本發明屬于酶工程和工業微生物技術領域，具體涉及一種改造腈水合酶及其應用。

背景技術：

微生物生產的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合產生的聚丙烯酰胺在三次采油、水處理、造紙等工業生產領域具有非常廣泛的應用。利用微生物產生的腈水合酶催化生產丙烯酰胺具有一系列優點，包括反應在常溫常壓下進行、能耗低、操作簡單、安全、丙烯腈轉化率高、產物濃度和純度高等，因此逐漸成為丙烯酰胺生產的主要方法。

微生物法生產丙烯酰胺的研究重點在于高產腈水合酶菌株的發現和改造以及對腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式會社對來自根瘤菌屬的腈水合酶基因和蛋白申請了專利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》(申請號：93106122.9)；三井化學株式會社對來自嗜熱假諾卡氏菌jcm3095的腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因申請了專利《參與活化腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因》(專利號：zl99106291.4)；《新型腈水合酶》(專利號：02156180.x)，并研究了該基因在重組大腸桿菌中的表達；德國底古薩股份公司申請了《紅球菌屬的腈水合酶》(申請號：200580008206.8)；清華大學公開了“一種腈水合酶及其編碼基因與應用”，構建了α亞基起始密碼子突變的腈水合酶，并在大腸桿菌中高活性表達(專利號：zl200410042576.0)；清華大學在專利“一種腈水合酶基因簇及其應用”中公開了紅色(赤)紅球菌rhodococcusruberth中與腈水合酶高表達相關的結構基因和調控基因序列(專利號：zl200910076710.1)。

除了產物/底物耐受性外，在微生物法生產丙烯酰胺的催化水合過程中，制約生產效率的另一個主要問題就是產酶細胞的耐熱性較差，水合溫度必須通過低溫制冷劑控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是強放熱反應，工業生產中控溫的冷量經常供應不足，導致水合溫度波動到25℃以上。較高的水合溫度一方面會加快反應速率，提高生產效率，另一方面則會造成腈水合酶的快速失活，減少反應批次，增加生產成本。日本三菱麗陽株式會社公開了專利《改良型腈水合酶》(公開號：cn1961072a)，對腈水合酶β亞基第93位、第167位和219位氨基酸殘基進行定點突變，提高了腈水合酶的熱穩定性；清華大學在專利“一種突變腈水合酶”中對腈水合酶β亞基的141位ser、143位ser、144位leu進行置換，使得腈水合酶的耐熱性、產物耐受性和超聲耐受性都有顯著提升(專利號：zl201110415465x)。

技術實現要素：

本發明為了提高腈水合酶的抗逆性、耐熱性和產物耐受性，提出一種改造腈水合酶及其應用。

具體技術方案如下：

一種改造腈水合酶通過將原腈水合酶的α亞基第215位氨基酸和β亞基第133位氨基酸之間形成二硫鍵改造而成。

進一步地，所述原腈水合酶的α亞基的氨基酸序列如序列表seqidno:2所示氨基酸序列；所述原腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如序列表seqidno:1所示氨基酸序列。

進一步地，所述二硫鍵形成的方法為：將seqidno:1所示氨基酸序列的215位asp置換為cys，將seqidno:2所示氨基酸序列的133位pro置換為cys。

一種編碼上述改造腈水合酶的基因。

進一步地，所述改造腈水合酶的基因序列如seqidno:3所示。

一種含有所述改造腈水合酶基因的表達載體。

進一步地，所述表達載體優選質粒。

進一步地，所述啟動子為原核生物啟動子，包含但不限于如pami，pa2，ptac，placz啟動子(劉昌春等.紅球菌啟動子識別及β-半乳糖苷酶報告基因表達.生物工程學報,2009,25(9):1360-1365.)。

一種含有所述改造腈水合酶基因或含有所述表達載體的轉化體。

進一步地，所述轉化體的構建方法為：將含有權利要求4所述改造腈水合酶基因直接插入受體菌的染色體，或采用氯化鈣法或電穿孔轉化法將含有權利要求6所述改造腈水合酶基因的表達載體導入受體菌。

進一步地，所述受體菌為大腸桿菌、紅球菌、諾卡氏菌或丙酸棒桿菌。

進一步地，所述轉化體在制備丙烯酰胺中的應用。

上述改造腈水合酶在制備丙烯酰胺中的應用。

本發明的有益效果：

1、本發明改造腈水合酶的抗逆性、耐熱性和產物耐受性都有顯著提升，并且沒有導致腈水合酶活性的降低。在60℃高溫下浸泡10min，改造后腈水合酶的殘留酶活是改造前腈水合酶殘留酶活的2.35倍；在高濃度丙烯酰胺溶液的浸泡下，改造后腈水合酶的殘留酶活是改造前腈水合酶殘留酶活的2.12倍。

2、改造腈水合酶可催化獲得高濃度丙烯酰胺產物，并且可以多批次回用。在利用丙烯腈生產丙烯酰胺的過程中，改造后腈水合酶可催化生產62％高濃度丙烯酰胺，而改造前腈水合酶僅可催化生成50％丙烯酰胺；在利用腈水合酶催化生產50％丙烯酰胺的批次反應過程中，改造后腈水合酶可實現連續4批次回用，而改造前腈水合酶僅可用1次，改造后腈水合酶綜合性能優勢明顯，具有良好的工業應用前景。

附圖說明

圖1為改造前、后腈水合酶的活性比較。

圖2為改造前、后腈水合酶的熱穩定性比較。

圖3為改造前、后腈水合酶的丙烯酰胺耐受性比較。

圖4為改造前、后腈水合酶催化丙烯腈生成高濃度丙烯酰胺比較。

圖5為改造后腈水合酶sbmdb生產得到的高濃度丙烯酰胺。

圖6為改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反應中丙烯酰胺濃度變化。

圖7為改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反應中電導率值變化。

具體實施方式

以下實施例便于更好地理解本發明，但不僅限于此。

以下實驗方法如無特殊說明均為常規方法；實驗試劑如無特殊說明均可從商業途徑獲得。

實施例1：改造后腈水合酶sbmdb基因置換過程

(1)以質粒pnv-sbm(陳杰等，耦合末端鹽橋與定點突變的重組腈水合酶催化動力學.化工學報，2014，65(7)：2821-2828)為模板，采用反向聚合酶鏈式反應(pcr)方法進行基因突變。首先對腈水合酶sbm的β亞基引入置換aspβ215cys。

采用正向引物sbm-beta215-sense：tgtgtagtgtgcgtcgatctctg；反向引物sbm-beta215-anti：tttcccgtttccgtcgtcg。

pcr反應體系為：

反應條件為：

所得pcr擴增產物利用omegabiotek公司生產的e.z.n.a.gelextractionkit凝膠回收試劑盒回收，回收過程按照說明書所述過程完成。所得dna片段進行磷酸化反應，磷酸化反應體系為：

反應條件為37℃，30min。

所得磷酸化產物利用omegabiotek公司生產的e.z.n.a.gelextractionkit凝膠回收試劑盒進行純化，純化過程按照說明書所述過程完成。純化片段利用t4dna連接酶在4℃進行連接反應16h；再將連接反應產物轉化宿主菌e.colibl21(de3)的感受態細胞(天根生化科技有限公司)，采用卡那霉素抗性(kan)lb固體培養基平板，挑選陽性克隆，所得重組質粒送鉑尚生物科技公司進行dna測序驗證。

lb培養基組成為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l，卡那霉素，50mg/l，瓊脂粉，15g/l，ph7.0。

以上述所得重組質粒為模板，繼續對腈水合酶α亞基引入置換proα133cys。突變方法與上述腈水合酶β亞基引入置換方法相似，采用正向引物為sbm-alpha133-sense：tgtcgtggagtgctcaagcg，反向引物為sbm-alpha133-anti：gtctgctaccactcgggaccg。

通過以上基因置換過程，即得到改造后的腈水合酶基因，其具有seqidno:3所示序列，將其命名為sbmdb。

實施例2：改造后腈水合酶轉化體的構建及改造腈水合酶在轉化體中的表達

將實施例1獲得的改造腈水合酶基因(seqidno:3所示)的質粒pnv-sbmdb采用電穿孔的方式轉入宿主菌紅色紅球菌r.ruberth3。轉化體采用含卡那霉素濃度為25mg/l的紅球菌平板培養基進行篩選，從而得到轉化體r.ruberth3/pnv-sbmdb。

得到的表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb進行搖瓶發酵培養。首先在含有25mg/l卡那霉素的紅球菌種子培養基中接種，于28℃、200rpm培養36h。

從培養得到的種子液中接種10％至紅球菌發酵培養基中，于28℃、200rpm培養48h。所得細胞進行酶活測定。

紅球菌平板培養基組成為：葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，nacl1g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，瓊脂15g/l。

紅球菌種子培養基組成為：葡萄糖20g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。

紅球菌發酵培養基組成為：葡萄糖30g/l，酵母膏7.5g/l，尿素10g/l，k2hpo4·3h2o2.28g/l，kh2po40.866g/l，mgso4·7h2o1g/l，谷氨酸鈉1g/l，cocl210.4mg/l。

酶活測定以丙烯腈為底物，采用氣相色譜法。取4.5ml10mmph7.0的磷酸鹽pbs緩沖液和0.1ml的菌液裝入10mlep管中，恒溫至28℃，加入200μl丙烯腈后迅速混勻，與此同時，按下秒表計時，準確反應5min后，加入200μl2.5mhcl終止反應。將反應液離心后，與4％的乙酰胺(內標)溶液等體積混合，采用氣相色譜儀trace1300(thermo，美國)內標法測量丙烯酰胺濃度。氣相色譜操作條件為：聚乙二醇高分子毛細管柱peg-20m(30m×0.25mm×2μm)，進樣口為spl，溫度260℃；fid檢測器，溫度260℃；柱溫190℃；載氣為氮氣，分壓為108kpa；分流進樣，進樣量0.4μl，分流比為50:1。

酶活測定結果表明，重組菌r.ruberth3/pnv-sbmdb表達改造腈水合酶的酶活為3452u/ml，改造前腈水合酶酶活為3601u/ml(如圖1)。改造后腈水合酶酶活僅略有下降。

實施例3：改造后腈水合酶的抗逆性評估

將實施例2中收獲的50ml表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb細胞(表達改造腈水合酶)與對照菌株r.ruberth3/pnv-sbm細胞用等體積的去離子水洗滌一次，再重懸于等體積的10mm的pbs緩沖液中。

各取5ml重懸的細胞，在60℃水浴中放置10min。對改造后腈水合酶和改造前腈水合酶的殘余酶活進行測定，結果表明，改造后腈水合酶的殘留酶活為69.40％，而改造前腈水合酶的殘留酶活僅為29.47％。改造后腈水合酶的熱穩定性顯著提升(如圖2)。

各取20ml重懸的重組細胞分別放置于100ml錐形瓶中，邊攪拌邊滴加丙烯酰胺，60％的丙烯酰胺以0.5ml/min的流速均勻滴加至錐形瓶中。每隔一段時間從錐形瓶中取出1ml混合液離心，所得沉淀用去離子水清洗三次后，測定殘余的腈水合酶酶活。當混合液中丙烯酰胺濃度達到40％時，改造后腈水合酶的殘留酶活為36％，而改造前的腈水合酶殘留酶活僅為17％。改造后腈水合酶的丙烯酰胺耐受性顯著提升(如圖3)。

實施例4：改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成高濃度丙烯酰胺

將實施例2中收獲的表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb細胞(表達改造腈水合酶)與對照菌株r.ruberth3/pnv-sbm細胞用等體積的去離子水洗滌一次，再重懸于等體積的去離子水中。

分別取400ml上述細胞懸浮液放置于1000ml三口瓶中，冰浴條件下進行水合反應。邊攪拌邊滴加丙烯腈，滴加速度以控制反應溫度為18-25℃來調節，當反應體系中丙烯腈濃度高于1％時，停止滴加丙烯腈。如圖4所示，改造后表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb細胞可催化生成濃度為62％的丙烯酰胺，最終生成的丙烯酰胺由于濃度過高從而產生晶體附著于瓶壁(如圖5)。而改造前菌株僅能催化生成濃度為50％的丙烯酰胺。

實施例5：改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反應

分別取400ml實施例4中所得的細胞懸浮液放置于1000ml三口瓶中，冰浴條件下進行水合反應。邊攪拌邊滴加丙烯腈，滴加速度以控制反應溫度為18-25℃來調節，當丙烯酰胺產物濃度達到50％時，停止滴加丙烯腈。反應得到的丙烯酰胺通過中空纖維膜與菌體分離，所得菌體回收并繼續進行下一批次水合反應，如此重復。反應過程中隔一段時間取樣測定反應液中的丙烯酰胺濃度和電導率值。如圖6所示，改造后表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb細胞可以完成4批反應，而改造前細胞僅能完成1批反應。在該反應過程中，改造后表達菌株r.ruberth3/pnv-sbmdb細胞電導值也明顯低于改造前菌株(如圖7)。說明改造后腈水合酶具有更加優良的水合催化效果，所得改造菌株在丙烯腈水合生成丙烯酰胺催化過程中具有更優秀的表現。

sequencelisting

<110>清華大學

<120>一種改造腈水合酶及其應用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>229

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metaspglyilehisaspthrglyglymetthrglytyrglyproval

151015

protyrglnlysaspgluprophephehistyrglutrpgluglyarg

202530

thrleuserileleuthrtrpmethisleulysglymetsertrptrp

354045

asplysserargphepheargglusermetglyasngluasntyrval

505560

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859095

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100105110

arglyspheaspproalagluileglulysalailegluargleuhis

115120125

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130135140

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225

<210>2

<211>203

<212>prt

<213>人工序列

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151015

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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gacgagcccttcttccactacgagtgggagggtcggaccctgtcgattctgacctggatg120

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