本發明屬于基因工程及酶工程技術領域，具體涉及一種高產重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2的構建及其在煙酸合成中的應用。

背景技術：

煙酸，又稱維生素pp或維生素b3，是人體必需的13種維生素之一，作為藥物中間體可合成多種用于治療皮膚性疾病、高血壓癥和冠心病等的藥物，如異煙肼、尼可剎米及煙酸肌醇酯等，還可以用做飼料或食品添加劑，具有廣泛的國內外市場。據統計，世界上年消耗煙酸8萬噸以上，目前都采用化學法生產，歐美產能約4萬噸。目前，我國生產煙酸的原料3-甲基吡啶和3-氰基吡啶基本依賴進口，其產品生產主要被幾個國際合資或獨資企業，如龍沙公司等壟斷。由于生產原料供應受限，我國一些化學法生產煙酸的廠家無論在生產裝置規模、產品質量和生產成本等方面也都難以與國外大公司抗衡，面臨嚴峻的技術和市場挑戰。

傳統的化學法生產煙酸需要消耗昂貴的氧化劑及貴金屬催化劑，并存在較為嚴重的環境污染。如，早期煙酸是通過氧化尼古丁制備獲得，后來逐漸發展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等為原料進行制備；我國目前工業生產中主要以3-甲基吡啶為原料，通過氧化反應制備獲得煙酸，而其中氧化方法主要分為液相氧化法和氣相氧化法，以上方法具有氧化劑價格昂貴，過程復雜，產物難分離，污染較嚴重及對生產設備要求高等不足之處。腈水解酶介導的微生物催化合成煙酸是近年來快速發展的可替代性顛覆技術，具有污染排放少、高效生物催化、生產成本低等比較優勢。

枯草芽孢桿菌作為一種傳統的、安全可靠的表達宿主，在工業、農業以及醫藥等領域有著廣泛應用，傳統的重組表達產腈水解酶多數需進行體外誘導，增加了工藝步驟和生產成本。構建高產腈水解酶的枯草芽孢桿菌表達體系，無需添加誘導劑，可降低生產成本及緩解對菌體或酶蛋白造成的毒害作用，對于工業規模煙酸的生物合成具有重要的研究意義和實踐價值。

技術實現要素：

本發明的目的是構建一種無需進行體外誘導并且高產腈水解酶的枯草芽孢桿菌表達體系，并應用于煙酸的生物轉化合成。

本發明采用的技術方案是：一種產重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌nit-2構建，方法如下：

1)腈水解酶基因nit的制備：提取惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830基因組，利用引物設計軟件oligo7設計引物2pu和a5d，pcr擴增得到兩端攜帶ndei和mlui酶切位點的腈水解酶基因nit，引物序列如下：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

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2)含ndei和mlui酶切位點pma5質粒的制備：利用ndei和mlui限制酶對pma5質粒進行雙酶切；

3)腈水解酶基因與pma5質粒的連接：連接經過ndei和mlui限制酶酶切后的腈水解酶基因nit與pma5質粒，得到重組質粒pma5-nit；

4)重組質粒的轉化：將重組質粒pma5-nit轉入b.subtiliswb600中，構建獲得可產重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2。該菌株保藏在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間2017年6月19日，分類命名枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，保藏編號為cgmccno.14255。

本發明還提供所述產重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌nit-2在轉化合成煙酸中的應用，所述應用為：以枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2在tb培養基中發酵獲得的菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，在ph7.2的磷酸鹽緩沖液中構成轉化反應體系，在30℃條件下進行轉化反應，采用hplc檢測轉化液中底物殘留情況，反應完全后，獲得的轉化液中即含有煙酸。

所述反應體系中底物投料濃度為50-200mm。

所述枯草芽孢桿菌經發酵培養獲得的含酶菌體的質量用量以菌體干重計為1.0～4.0g/l。

本發明所述檢測底物3-氰基吡啶和產物煙酸的高效液相色譜條件為：dionex3000型高效液相色譜儀，色譜柱為waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱溫30℃，流速為0.5ml/min，紫外檢測波長268nm，流動相為乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)。

本發明的有益效果主要體現在：(1)本發明首次成功構建了產惡臭假單胞菌重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2，其無需進行體外誘導便可高效表達腈水解酶，降低了生產成本，提高了工藝效率，可為生物催化合成煙酸提供廉價的催化劑；(2)枯草芽孢桿菌作為一種傳統的基因工程菌株，不僅生長周期較短，而且在工、農、醫等領域均具有重要應用價值，其作為宿主菌表達的目的蛋白安全、可靠，本發明中所構建的含腈水解酶的枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2，在生物催化生產煙酸中，提升了生產的煙酸的安全層級，能夠滿足該煙酸產品在食品、醫藥等安全較高領域的應用；(3)本發明將枯草芽孢桿菌nit-2用于生物催化生產煙酸，結果表明，該菌可有效生物催化生產煙酸，3-氰基吡啶轉化率可達到100％，在生物催化生產煙酸領域具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2用于生物催化生產煙酸過程曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1：產重組腈水解酶的枯草芽孢桿菌bacillussubtilisnit-2的構建

1)腈水解酶基因nit序列的擴增：從惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830中提取基因組dna，作為模版，設計上下游引物2pu及a5d，在兩端分別添加ndei和mlui酶切位點，進行pcr擴增，引物：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

a5d：5'-cgacgcgttcagctctcttcatggaccttaa-3'

pcr擴增體系：

pcr反應程序：在95℃預變性3min后開始循環，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環；于72℃下終延伸5min；12℃保溫獲得兩端攜帶ndei和mlui酶切位點的腈水解酶基因nit。

2)含ndei和mlui酶切位點pma5質粒的制備：利用ndei和mlui限制酶對pma5質粒進行雙酶切，酶切體系設計如下：

經瓊脂糖凝膠電泳分析回收獲得兩端攜帶ndei和mlui酶切位點的pma5質粒。

3)腈水解酶基因與pma5質粒的連接：連接經過ndei和mlui限制酶酶切后的腈水解酶基因與pma5質粒，得到重組質粒pma5-nit，連接體系設計如下：

4)重組質粒的轉化：將重組質粒pma5-nit轉入b.subtiliswb600中，得到可產腈水解酶的枯草芽孢桿菌nit-2。

實施例2：枯草芽孢桿菌nit-2游離細胞的制備

將于tb培養基中培養8～10h的發酵液于12000×g離心1min后棄去上清液，再用ph7.2、100mm磷酸鈉緩沖液(pbs)重懸菌體并洗滌2～3次，得到除去培養基殘液的菌體，最后用相同的磷酸鈉緩沖液重懸菌體得到游離細胞懸浮液，測定菌體濃度后保存于4℃冰箱中備用。

實施例3：生物轉化合成煙酸

將制備的游離細胞菌懸液(100ml，菌體干重為2.87g/l)與1.04g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為100mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，即獲得含煙酸的轉化液。

枯草芽孢桿菌nit-2游離細胞能夠在13min內完全轉化100mm底物，3-氰基吡啶的轉化率可達到100％，hplc未檢測出副產物煙酰胺生成，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為16.72g/h。

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