一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法
【專利摘要】本發明涉及一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，包括如下步驟：將惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，經光照、溫度為30℃，搖床轉速200r·min-1，培養96h后得到具有腈水合酶活力的發酵液。本發明的光敏性腈水合酶惡臭假單胞菌菌種，經傳統發酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，且無副產物，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。
【專利說明】一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于工業微生物【技術領域】，具體涉及一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法。
【背景技術】
[0002]丙烯酰胺是一種用途廣泛的有機化工原料，以它為單體合成的產品不下百種，其中以聚丙烯酰胺用途最廣。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田調整吸水剖面和“三次采油”中，近年來，為適應我國原油“三次采油”對超高分子量聚丙烯酰胺(相對分子質量> 2000萬)的需求，丙烯酰胺的生產將有較大的發展。
[0003]丙烯酰胺是以丙烯腈為原料水合而成，從20世紀50年代至今，生產工藝先后經歷了硫酸水合、銅系催化的化學水合及微生物腈水合酶生物轉化3個發展階段。1973年，法國研究者Galzy及其研究組發現了一種能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312,從而開始了用微生物生產丙烯酰胺的研究。1985年，日本日東公司建成了世界上第一個微生物法生產丙烯酰胺的工業性裝置。上海農藥所也在1986年從泰山的土壤中找到了一株產腈水合酶的菌株，并開始了微生物法生產丙烯酰胺的研究。腈水合酶是一種可以把腈化合物的腈基進行水合后轉變為酰胺基，制造對應的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作為催化劑催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成為主流。與銅系催化法相比，微生物法有許多優點:酶催化反應在常溫、常壓下進行，提高了生產安全性；丙烯腈的轉化率接近100%，不需回收未反應原料；由于省去了銅分離工段，產品中不含銅離子，產品純度高，特別適合生產超高分子量的聚丙烯酰胺；工藝過程簡單，設備投資少，生產經濟效益高。微生物法催化生產丙烯酰胺是石油化工骨干產品利用酶催化技術成功的第一范例，具有劃時代的意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，本發明的光敏性腈水合酶菌株是一種惡臭假單胞菌，經傳統發酵、催化合成丙烯酰胺，利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，無副產物，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。
[0005]本發明所采用的技術方案是:一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法。
[0006]一:催化劑制備
菌體發酵培養:將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌體接種于固體培養基,活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，經光照、溫度為30°C,搖床轉速200r.mirT1,培養96h后得到具有腈水合酶活力的發酵液，且發酵液的總酶活達800~1200萬單位/毫升發酵液；
固體培養基配方為:葡萄糖1%、酵母浸膏0.36%、K2HPO4.3Η200.2 %、NaCl 0.1%, MgSO4?7H20 0.015%，瓊脂2%、余量為脫鹽水；
發酵培養基配方為:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素
0.5 ~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，Fe3+
0.0001~0.003%, pH值7.5~8.5，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
[0007]上述發酵過程中添加的Fe3+為FeCl3、Fe2 (SO4) 3、Fe (NO)3中的任意一種。
[0008]上述所述光照條件為培養階段可見光照射發酵液。
[0009]催化劑懸浮液制備:將發酵液在分離因素> 3000離心分離，去上清液，將細胞懸浮于脫鹽水中，配成 菌體細胞與脫鹽水體積比為1:100~1:200的催化劑懸浮液備用。
[0010]含有光敏性腈水合酶菌株催化合成丙烯酰胺的方法包括如下步驟:向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，常壓，溫度為30°c，200r.mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20~30% (wt)，經過一段時間的反應，獲得丙烯酰胺溶液；
本發明所具有的有益效果是:通過在傳統發酵培養基中加入Fe3+，并在發酵過程中采用可見光照射發酵液的方法，產生含有腈水合酶的惡臭假單胞菌菌株或其誘變菌株細胞，并將該細胞從培養液中分離制成催化劑懸浮液，催化丙烯腈水合成丙烯酰胺水溶液，丙烯腈的轉化率可達99.99%，所獲得的丙烯酰胺水溶液經過納濾、離子交換等工序，即可獲得高純度的丙烯酰胺水溶液。本發明通過在發酵過程中采用光照條件，并在培養基中加入Fe3+，顯著提高了腈水合酶的酶活性，將酶活性提高50%以上的同時使發酵的培養周期大大縮短了。利用本發明菌株及催化方法合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，且無副產物，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。
[0011]本發明中菌株、Fe3+、光照條件互相協調作用才能高效生產含有腈水合酶的惡臭假單胞菌菌株或其誘變菌株細胞，進而催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。本發明使用的惡臭假單胞菌菌株及其誘變菌株產生的腈水合酶可將丙烯腈高效轉化成丙烯酰胺，其操作過程簡單、反應條件溫和、對環境污染小、分離提純簡單、丙烯腈轉化率高、產品純度高。
[0012]【具體實施方式】:
實施例1:
(I)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發酵液。
[0013]發酵培養基:葡萄糖1.5%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.07%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%，Fe3+ 0.001%, pH 值 8，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
[0014]通過稱量法測定菌株生物量。取IOmL發酵液，在分離因素為3000，離心分離，去上清液，用蒸餾水洗滌三次后，將獲得的細胞置于紅外干燥箱內，105°C干燥至恒重，取出放入干燥器內，冷卻后稱量。由上述方法測得的產酶能力為25.3毫克/毫升發酵液。
[0015]采用高壓液相色譜法(HPLC)分析丙烯腈及轉化產物丙烯酰胺，配制兩者的混合溶液做標準曲線，通過外標法定量，測定反應液中腈水合酶活力.由上述方法測得的腈水合酶活力為950u/mL。
[0016]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0017](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應體系的20%(wt)，經過一段時間的反應，獲得濃度為26.75%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率99.81%。
[0018]實施例2:(I)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發酵液。
[0019]發酵培養基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.0015%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
[0020]通過上述稱量法測定菌株生物量為29.6暈克/毫升發酵液。
[0021]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為1207u/mL。
[0022]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0023](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應體系的25%(wt),經過一段時間的反應，獲得濃度為33.5%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率99.99%。
[0024]實施例3:
(1)、催化劑懸浮液的制取:按前述方法制備催化劑，得含腈水合酶菌株的發酵液。
[0025]發酵培養基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.6%，谷氨酸0.075%,尿素0.75%，K2HPO4.3Η200.05%, KH2PO40.05%, MgSO4.7Η20 0.05%, Fe3+ 0.003%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
[0026]通過上述稱量法測定菌株生物量為30.5暈克/毫升發酵液。
[0027]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為1000u/mL。
[0028]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0029](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應體系的30%(wt)，經過一段時間的反應，獲得濃度為40.17%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率99.93%。
[0030]實施例4:
本實施例在發酵過程中未加入Fe3+，也沒有光照條件，以和上述實施例3進行對比。
[0031](I)、催化劑懸浮液的制取:菌體發酵培養:將惡臭假單胞菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，溫度為30°C，搖床轉速200r.mirT1，培養96h后得到具有腈水合酶活力的發酵液。
[0032]發酵培養基:葡萄糖2%，酵母浸膏0.5%，谷氨酸0.075%,尿素0.7%，K2HPO4.3Η200.05%，KH2PO40.05%，MgSO4.7Η20 0.05%, pH 值 8.4，余量為脫鹽水；上述百分比
為質量百分比。
[0033]通過上述稱量法測定菌株生物量為13.7暈克/毫升發酵液。
[0034]采用高壓液相色譜法測得的腈水合酶活力為289u/mL。
[0035]按前述方法制備催化劑懸浮液備用。
[0036](2)、按前述方法催化丙烯腈合成丙烯酰胺，丙烯腈的添加量占反應體系的30%(wt)，經過一段時間的反應，獲得濃度為8.2%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率20.4%.。
[0037]本發明與現有技術相比具有以下特點:
現有技術用于催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的菌株主要有紅球菌屬、棒桿菌及其經誘變的菌種。本發明的菌種屬于假單胞菌屬。該菌株在發酵過程中加入Fe3+，并采用光照的條件時，使該菌種產酶能力大幅度提高，生物量最高達30mg/ml發酵液，而且其單位體積發酵液的總酶活可達1200萬單位/毫升發酵液。
【權利要求】
1.一種催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，其特征在于:菌體發酵培養:將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌體接種于固體培養基,活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，經光照、溫度為30°C，搖床轉速200r.mirT1，培養96h后得到具有腈水合酶活力的發酵液，且發酵液的總酶活達800~1200萬單位/毫升發酵液；發酵培養基配方為:葡萄糖I~3%，酵母浸膏0.5~1%，谷氨酸0.05~0.1%，尿素0.5~1%，K2HPO4.3Η200.03 ~0.1%，KH2PO40.03 ~0.1%，MgSO4.7Η20 0.03 ~0.1%，Fe3+ 0.0001 ~0.003%, pH值7.5~8.5，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
2.權利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，其特征在于:菌體發酵培養中培養階段要有可見光照射發酵液。
3.權利要求1所述的催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的發酵方法，其特征在于:所述的Fe3+為FeCl 3' Fe2 (SO4) 3、Fe (NO) 3中的任意一種。
【文檔編號】C12P13/02GK103834600SQ201410096647
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優先權日:2014年3月17日
【發明者】孫安順 申請人:蔡建華