本發明涉及一株產三萜類化合物的滴孔菌及其在制備三萜化合物中的應用，屬于生物技術領域。

背景技術：

近年來，食藥用高等真菌越來越受到廣泛關注，不僅因為它具有極高的營養價值，更重要的是其能夠產生具有各種生物活性的次級代謝產物。高等真菌次級代謝產物中，藥理作用研究較清楚的是三萜類化合物，近年的研究表明，三萜類化合物具有抗腫瘤、抗艾滋病病毒hiv-1、解毒保肝、抗菌和抑制前列腺增生等功能。

目前對三萜類化合物產生菌的研究主要集中在靈芝菌科ganodermatoideae和多孔菌科polyporaceae。由于高等真菌的子實體培養周期較長，三萜的產量受外界因素影響較大，因此，從子實體中提取三萜酸成分具有較大的局限性。通過液體深層發酵技術生產三萜類化合物具有生產周期短、不受季節影響、可以大批量生產、三萜類化合物含量相對穩定，適合工廠化生產等特點，有望成為生產三萜類化合物的主要方法。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株可產三萜類化合物的滴孔菌菌株及其在制備三萜類化合物中的應用。利用本發明所述菌株可以產生三萜類化合物，實現通過微生物液體發酵法獲得以三萜類化合物為主要目的產物的愿望。

本發明所述產三萜類化合物的滴孔菌a-9屬于多孔菌科滴孔菌屬，其特征在于：該菌株名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為cgmccn0.13895。

上述產γ-癸內酯及三萜類化合物的滴孔菌a-9是一株發明人自主野外采摘分離純化得到的滴孔菌，其生物學特征是：子實體無柄，呈現半圓形，大小約20×15cm，單片菌蓋厚度約0.5-1.5cm，菌蓋覆瓦狀排列。子實體正面呈現淡黃色至橙色，邊緣顏色較深，呈現波浪狀或瓣狀，較圓滑，子實體背面呈現白色，邊緣黃色，布滿菌孔。菌絲系統二體型，具有生殖菌絲和骨架菌絲。生殖菌絲具有擔子菌菌絲的顯著特點，即鎖狀聯合。同時該菌生殖菌絲還具有簡單隔膜，但是簡單隔膜的數量較少，且往往出現于菌絲的前端。生殖菌絲的直徑從2-3μm到5-7μm不等。

對本發明所述產三萜類化合物的滴孔菌a-9cgmccn0.13895測定18srrna以及its的基因序列的結果顯示，其18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。通過形態觀察和18srrna以及its的基因序列比對，初步鑒定為piptoporussp.。

本發明所述產三萜類化合物的滴孔菌a-9菌種選育的基本方法是：

菌種系采自于野外的擔子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養。待菌絲墊直徑達2-3厘米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經反復多次轉接，直至分離得到純菌種。將該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，該菌株已于2017年5月25日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為cgmccn0.13895。

本發明所述產三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在制備三萜類化合物中的應用。

其中，所述應用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養活化：將菌種接種于斜面培養基，30～35℃條件下，靜止培養96～102小時，備用；

(3)種子培養：將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環于90～100ml液體種子培養基中，置旋轉轉速為160～180轉/分鐘、旋轉半徑為40mm的搖床上，27～33℃培養72～96小時，得種子液；

(4)以三萜類化合物為目的產物發酵培養：

搖瓶發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有80～100ml發酵培養基的搖瓶中，27～33℃，轉速為150～180轉/分鐘，ph為6.0±0.5，搖瓶發酵144～168小時，即獲得含三萜類化合物的發酵產物；

其中：上述斜面培養基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；

上述以三萜類化合物為目的產物的發酵培養基的組成為：蔗糖10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，七水合硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，十二水合磷酸氫二鈉1.2g/l；去離子水1l；ph6，滅菌117℃，30min。

上述的應用中，步驟(2)、(3)、(4)所述培養溫度優選30℃。

上述的應用中，步驟(2)所述培養時間優選100小時。

上述的應用中，步驟(3)所述培養時間優選80小時。

上述的應用中，步驟(4)所述培養時間優選150～160小時。

上述的應用中，步驟(4)所述發酵培養基初始蔗糖濃度優選20g/l～30g/l。

上述的應用中，步驟(4)所述發酵過程中搖瓶發酵的ph優選6.0。

上述三萜類化合物按下述方法測定：

三萜類化合物提?。焊稍镏梁阒氐牡慰拙鷄-9菌體粉碎，置于50ml離心管中，加無水乙醇50ml，超聲處理(400w,55khz)30min,濾過，濾渣重復上述操作1次，合并濾液。濾液旋轉蒸發儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的發酵液，加2倍無水乙醇，醇沉，離心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇與發酵液混合液利用旋轉蒸發儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。

吸光度檢測：將所得樣品分別搖勻，用移液槍吸取適量溶液，水浴蒸干后各加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測量吸光度。

本發明公開了一株產三萜類化合物的滴孔菌(piptoporussp.)a-9，作為自主采摘分離鑒定的新菌株，發明人未檢索到有關利用滴孔菌a-9以生產三萜類化合物為目的產物的文獻報道。實驗證實利用本發明所述滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895可直接發酵生成并獲得目的產物三萜類化合物，菌種發酵性能穩定，是一株極具研究開發價值的三帖類化合物生產菌株。其為液體發酵生產三萜類化合物探索了新的方向與途徑，為將來進行發酵生產打下基礎。

本發明采用生物發酵的方法，以蔗糖、豆粕粉等為原料生產三萜類化合物，具有生產方法簡單，條件溫和，原料來源豐富，生產成本低等特點，發酵生產的三萜類化合物產量最高可達2.1g/l以上，具有較高的應用價值，極具工業化應用前景。

具體實施方式

實施例1產三萜類化合物的滴孔菌菌株分離純化

菌種系采自于野外的擔子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養。待菌絲墊直徑達2-3厘米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經反復多次轉接，直至分離得到純菌種。將目的菌株再經搖瓶發酵復篩和進一步分離篩選，得到一株性能穩定的三萜類化合物產生菌，該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9。

上述菌株滴孔菌a-9已于2017年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，其保藏編號為cgmccn0.13895。

上述液體種子培養基組成(g/l)：鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。

上述斜面培養基組成為(g/l)：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda。

實施例2滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列測序

將實施例1分離純化得到的產三萜類化合物菌株即cgmccn0.13895菌株委托博尚生物公司進行18srdna測序。

實驗方法是：挑取斜面培養物,提取基因組作為模板，分別以通用引物ns1，ns8擴增18srrna基因，片段大小為約1.8kb，以通用引物its1，its4擴增its序列，片段大小約為750bp。

取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳，使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切膠回收目的片斷，對上述回收產物進行dna測序。

測序結果：cgmccn0.13895菌株18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；cgmccn0.13895菌株its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。

表1所用引物列表

實施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在制備三萜類化合物中的應用

應用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養活化：將菌種接種于斜面培養基，30℃條件下，靜止培養100小時，備用；

(3)種子培養：將步驟(2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1～2環于90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養基中，置旋轉轉速為160轉/分鐘、旋轉半徑為40mm的搖床上，30℃培養80小時，得種子液；

(4)搖瓶發酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有90-100ml(500ml三角瓶)發酵培養基的搖瓶中，30℃，轉速為160轉/分鐘，搖瓶發酵160小時，即獲得含三萜類化合物的發酵產物；

上述斜面培養基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；

上述發酵培養基的組成為：蔗糖30g/l，豆粕粉30g/l，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph6，滅菌117℃，30min。

(5)產物檢測：取適量樣品水浴蒸干后加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測量吸光度；

經檢測發酵液中菌體和上清的總三萜類化合物的含量為2.1g/l。

上述三萜類化合物按下述方法測定：

三萜類化合物提?。喝∵m量培養物離心3000rpm，10min，沉淀的菌體于100℃烘箱中干燥至恒重，粉碎成末，置于50ml離心管中，加無水乙醇50ml，超聲處理(400w,55khz)30min,濾過，濾渣重復上述操作1次，合并濾液。濾液旋轉蒸發儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。將離心后的上清液，加2倍無水乙醇，醇沉，離心，8000rpm，10min，除去沉淀多糖，之后得到的乙醇與發酵液混合液利用旋轉蒸發儀60℃蒸干，用甲醇定容至10ml容量瓶中。所得的樣品用于分析。

吸光度檢測：將所得樣品分別取適量于10ml離心管中，水浴蒸干后各加入0.3ml5％香草醛冰醋酸溶液(0.5g香草醛加入10ml冰醋酸溶解)，再加入1.0ml高氯酸輕輕震蕩后密封，于70℃水浴加熱25min，取出后立即冰水冷卻至30℃后加冰醋酸5ml，快速搖勻，放置20min，在540nm處測量吸光度。

序列表

<110>山東大學

<120>一株產三萜類化合物的滴孔菌及其應用

<141>2017-06-14

<160>2

<210>1

<211>1679

<212>rdna

<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9

<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列

<222>（1）…（1679）

<400>1

cagtttgtactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggta60

ccttgctacatggataactgtggtaattctagagctaatacatgcaatcaaagccccgac120

ttctggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaacgcggttcgccgctccattggtga180

ttcataataacttctcgaatcgcatggccttgtgccggcgatgcttcattcaaatatctg240

ccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggtttcgacgggtaacggggaa300

taagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagc360

aggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaataacaatatagg420

gctcttttgggtcttataattggaatgagtacaatttaaatcccttaacaaggaacaatt480

ggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaag540

ttgttgcagttaaaacgctcgtagttgaacttcagacctggccgggtggtctgcctaacg600

gtatgtactgtctggctgggtcttacctcttggtgagccggcatgccctttactgggtgt660

gtcggggaaccaggacttttaccttgagaaaattagagtgttcaaagcaggcctatgccc720

gaatacattagcatggaataataaaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaga780

gtcgccgtaatgattaatagggatagttgggggcattagtattcagttgctagaggtgaa840

attcttggatttactgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcatta900

atcaagaacgaaggttaggggatcgaaaacgatcagataccgttgtagtcttaacagtaa960

actatgccgactagggttcgggcgatctcaaatttatgtgtcgctcggcaccttacgaga1020

aatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattg1080

acggaagggcaccaccaggtgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaact1140

caccaggtccagacataactaggattgacagattgatagctctttcataattttatgggt1200

ggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgataacgaa1260

cgagaccttaacctgcttaatagccaggccggcttttgctggtctccggcttcttagagg1320

gactgtctgtgtctaacagatggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttaga1380

tgttctgggccgcacgcgcgctacactgacagaaccagcgagtttttttctcccttggcc1440

ggaaggtctgggtaatcttgtgaaactctgtcgtgctggggatagagcattgcaattatt1500

gctcttcaacgaggaatacctagtaagcgcgagtcatcagctcgcgttgattacgtccct1560

gccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggtttagtgaggtcttggga1620

ttggcttcggggagccggcaacggcaccttgctgctgagaacttgatcaaacttggtca1679

<210>2

<211>727

<212>dna

<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9

<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的its序列

<222>（1）…（727）

<400>2

tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattatcgaattttgaattgggttgtagctggcct60

ccgggcatgtgcacatccttttctttaacacacacacacacacacaccttgtgcactcac120

tgtaggctggggttgaaaagggttgttgggttgccttcgggttctaactcctaaccccag180

tttatgtttttatatctacccactccaagtcatagaatgtcattgatgcgtctaacgcaa240

tgttgggaataatataactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacg300

cagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaac360

gcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatacctgtttgagtatcatggaactctca420

actcattcattcttgttatatagtgtgagtgggcttggacttggaggctttgctggtgca480

tgaaatggcatcggctcctcttgaatgcattagcttgaacctatgtggggtggatcggct540

atcggtgtgataatatttgtctatgccgggttgtgaaagagccctgggttacccttctgt600

ttggggggggatttcaagcttctaatctctgagttgggaccattttcttgggaccatttc660

ttcttacctctgatctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataag720

cggagga727