本發明涉及植物培育領域，具體而言，涉及一種無病毒栝樓的培養方法。
背景技術：
：栝樓，葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，別名瓜蔞、吊瓜、野葫蘆等。《中華醫藥》記載，其果實、根是常用的名貴中藥，栝樓有解熱止渴、利尿、鎮咳祛痰等作用。種子含脂花肪油；果實含三萜皂苷、有機酸、樹脂、糖類、色素；根含蛋白質、皂苷、酸類。栝樓是治療肺熱、腫痛的特效藥，近些年發現其還有調節免疫、抗心肌缺血、抗癌抗衰老等醫療和保健作用。目前，栝樓的繁殖主要為無性繁殖方式，即采用塊根小段無性繁殖；但栝樓在無性繁殖過程中，容易感染病毒，使優良品種退化。因此，為培育無病毒的栝樓優良種系，特提出本專利技術。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種無病毒栝樓的培養方法，該培養方法易于控制實施，可在較短的時間內繁殖得到大量的無病毒的優良種系，提高栝樓種苗的品質。為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：一種無病毒栝樓的培養方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養基中進行培養，直至培養出含20～30個小芽的芽叢；將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1～2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株并轉入第三培養基中進行生根培養，得到組培苗。一種栝樓的脫毒培養方法，其包括：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養基中進行培養，直至培養出含20～30個小芽的芽叢；其中，第一培養基是由ms培養基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本公開內容提供的這種無病毒栝樓的培養方法，采用帶有1～2個葉原基的莖尖進行愈傷組織培養，使其生長、分化形成無病毒的栝樓苗。該方法是基于病毒在植物體內分布不均勻的理論，即植物的莖尖分生組織一般不帶病毒的，所以通常采用0.1毫米左右的莖尖分生組織，帶1-2個葉原基，進行培養，即可得到無病毒種苗，故而無需進行病毒鑒定工作即可進行擴大繁殖。該培養方法易于控制實施，操作相對較簡單，成苗時間短，可在較短的時間內繁殖得到大量的無病毒的優良種系，提高栝樓種苗的品質。通過這種培養方法培育的無病毒栝樓，具有生長健壯、不帶病毒、品質優良的特性，從而大幅提高栝樓藥材的質量和藥效。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。本實施方式提供一種無病毒栝樓的培養方法，其包括下述步驟：步驟s1初代培養：取栝樓苗的莖尖分生組織，將帶有1～2個葉原基的莖尖接種到第一培養基中進行培養，直至培養出含20～30個小芽的芽叢。在本實施方式中，栝樓苗既可以為無菌苗，也可以為大田兩年生的正常苗，都可以滿足初代培養的植株取材需求。較為具體的，將栝樓苗在無菌條件和解剖顯微鏡下剝取莖尖分生組織，以帶有1～2個葉原基的莖尖為度，莖尖分離后，迅速接入第一培養基中。值得強調的是，由于本實施方式提供的培養方法，選用的植物組織為莖尖分生組織，該分生組織一般不帶病毒，所以采用0.1毫米左右的帶1～2個葉原基的莖尖分生組織，進行培養，即可得到無病毒苗，故而無需進行病毒鑒定工作即可進行擴大繁殖。可選擇的，培養莖尖的條件為：環境溫度23～28℃、日照時間13～14h、光照強度1200～1300lx、相對濕度75～85％。進一步優選的，培養莖尖的條件為：環境溫度24～27℃、日照時間13.4～13.7h、光照強度1230～1280lx、相對濕度78～82％；更為具體的培養條件為：環境溫度25℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。在這些條件下，進行莖尖分生組織的培養，莖尖所處的環境適宜，生長和分化速度快，能夠在相對較短的時間內長出小芽，形成芽叢，發芽率高、培養周期短。進一步的，第一培養基是由ms培養基與0.45～0.55mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的；或者第一培養基是由ms培養基與0.5mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。第一培養基采用ms培養基為基礎培養基，其中，ms培養基具有無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數植物組織培養快速繁殖用它作為培養基的基礎培養基。ms培養基可以采用現有技術中的配方進行配置。當然，也可以用其他配比的ms培養基。在本發明較佳的實施例中，發明人經過多次實踐探索之后，優選得到的ms培養基的重量百分比組分為：30-35％的硝酸銨、40-42％的硝酸鉀、7-8％的硫酸鎂、8-10％的二水氯化鈣、3.5-4％的磷酸二氫鉀、1.2-1.5％的鐵鹽、0.05-0.1％的微量元素，余量為有機物。其中，鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉與硫酸亞鐵的混合物，二者的質量比為10～11：9。微量元素由碘化鉀、硼酸、一水硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷的一種或多種組成，有機物由肌醇、煙酸、vb6、vb1、甘氨酸的一種或多種組成。采用這種ms培養基為基礎培養基，其所含的離子濃度更加適合瓜蔞子莖尖的生長、分化。6-芐氨基嘌呤，是一種人工合成的細胞分裂素，能夠誘導芽的分化。萘乙酸，是一種光譜型的植物生長調節劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根。發明人通過調節這兩種激素的含量，得到一種能夠促進莖尖誘導和分化的培養基，無需分步培養，且生長快，分化率高。步驟s2繼代培養：將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1～2cm的叢生苗。可選擇的，第二培養基是由ms培養基與0.09～0.11mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.04～0.06mg/l的萘乙酸混合后形成的。較為優選的，第二培養基是由ms培養基與0.10mg/l的6-芐氨基嘌呤、以及0.05mg/l的萘乙酸混合后形成的。該培養基適合芽叢的誘導分化，發育成叢生苗。可選擇的，該培養方法還包括：將叢生苗分成單株后再轉入另一個第二培養基中進行擴大培養，得到大量的叢生苗。此為擴大繁殖步驟，由于一個芽尖分化得到的芽叢數量有限，為了避免反復取材進行初代培養，在本發明較佳的實施例中，將繼代培養后得到的1～2cm的叢生苗分成單株，再重新接種至新的第二培養基中，進行分化培養，由此可得到大量的叢生苗，大幅提高培養效率，縮短培養時間以及降低培養成本。步驟s3生根培養：將叢生苗分成單株并轉入第三培養基中進行生根培養，得到組培苗。可選擇的，第三培養基是由ms培養基與0.18～0.22mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。較為優選的，第三培養基是由ms培養基與0.20mg/l的吲哚丁酸混合后形成的。吲哚丁酸，使一種植物生長激素，能夠促進植物生長，尤其是促進植物根系的生長發育。該培養基適合叢生苗的誘導分化，能夠促進叢生苗根系的生長。進一步的，在本發明較佳的實施例中，還包括將組培苗進行馴化培養。通過馴化培養，篩選得到長勢健壯、不帶病毒、品系優良的栝樓植株。可選擇的，馴化培養包括：將組培苗根部的培養基清洗后晾置0.5～1.5h，再將組培苗插入基質中進行培養；其中基質為經消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。進一步的，為了提高根系的成活率，將組培苗根部的培養基清洗后，于溫度為18～22℃、濕度為78～82％的環境下晾置0.5～1.5h，優選的，將組培苗根部的培養基清洗后，于溫度為20℃、濕度為80％的環境下晾置1h，進行移栽。更為具體的，將組培苗插入基質中，壓實組培苗基本周圍的基質，澆透水，以利幼苗基部和基質緊密接合，直至根系生出，逐漸降低濕度和土壤含水量。通過上述培養方法培育得到的栝樓，具有生長健壯、不帶病毒、品質優良的特性，從而能夠大幅提高栝樓藥材的質量和藥效。以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述：實施例1本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出30個小芽的芽叢。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.45mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.09mg/l)+萘乙酸(0.06mg/l)。第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.22mg/l)。實施例2本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出25個小芽的芽叢。培養條件為：白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃、日照時間14h、光照強度1200lx、相對濕度85％。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實施例3本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有2個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出20個小芽的芽叢。培養條件為：白天溫度為26℃，夜間溫度為23℃、日照時間13h、光照強度1300lx、相對濕度75％。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.55mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出2cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.11mg/l)+萘乙酸(0.04mg/l)。第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.18mg/l)。實施例4本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出25個小芽的芽叢。培養條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉入另一個所述第二培養基中進行擴大培養，得到大量的叢生苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。實施例5本實施例提供一種無病毒栝樓的培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出25個小芽的芽叢。培養條件為：白天溫度為27℃，夜間溫度為24℃、日照時間13.5h、光照強度1250lx、相對濕度80％。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.5mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1.5cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，再轉入另一個所述第二培養基中進行擴大培養，得到大量的叢生苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.10mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。d.將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.20mg/l)。e.將組培苗根部的培養基清洗后晾置1h，再將組培苗插入基質中進行培養；其中基質為經消毒處理后的腐殖土、蛭石和河砂的混合料。對比例1本對比例提供一種栝樓種苗，其培育方法，其包括：a.按常規方法配制ms培養基。b.取栝樓的無菌苗在無菌條件和解剖顯微鏡下，解剖剝取莖尖分生組織(20個)，以帶有1個葉原基的莖尖為度,莖尖分離后，迅速接入第一培養基中進行培養，直至培養出20個小芽的芽叢。培養條件為：白天溫度為30℃，夜間溫度為25℃、日照時間12h、光照強度1500lx、相對濕度75％。其中，第一培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.1mg/l)+萘乙酸(0.05mg/l)。c.將芽叢轉入第二培養基中，培養至長出1cm的叢生苗后，將叢生苗分成單株，并轉入第三培養基中進行生根培養，得到無病無的栝樓組培苗。其中，第二培養基包括：ms培養基+6-芐氨基嘌呤(0.12mg/l)+萘乙酸(0.07mg/l)。第三培養基包括：ms培養基+吲哚丁酸(0.27mg/l)。觀察實施例1～5以及對比例1在在培養過程中的分化情況，并記算出芽數、分化率、出苗總數和出苗率，結果如表1所示：表1.實施例1～5以及對比例1的培養結果分化出芽的芽尖數(個)分化率(％)出苗總數(株)出苗率(％)實施例11470％1890％實施例21575％20100％實施例31680％24120％實施例41680％67335％實施例51785％70350％對比例1735％1575％由表1可知，本發明實施例1～5所提供的培養方法，用20個植物分生組織進行培養，分化出芽的芽尖數在14個以上，分化率(分化出芽的芽尖數/接入的芽尖數×100％)在70％以上，遠大于對比例1提供的培養方法(分化出芽的芽尖數為7個，分化率為35％)，由此可見，本發明實施例1～5所提供的培養方法，在芽尖分化培養階段，分化率高、且分化出芽生長快；進一步培養后的，實施例1～5中，由于培養基營養好，培養條件適宜，芽生長快，植物健壯，因此出苗率(出苗數/接入的芽尖數×100％)高達90％以上。值得注意的是，實施例4～5的出苗率高達330％以上，這主要是因為在培養得到叢生苗之后，還將其分成單株后，進行擴大培養，得到大量的叢生苗，從而大幅提高叢生苗的數量。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁12