本披露涉及一種用于生成胰腺譜系細胞，例如胰腺β細胞的方法，該方法包括以下步驟：在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養后前腸細胞的細胞群體不超過大約84小時。本披露還涉及能通過所述方法獲得的胰腺譜系細胞及其醫學用途。

背景技術：

1、根據國際糖尿病聯盟的數據，糖尿病是一種重大的全球健康危機，影響著全世界超過2億-3億人。1型糖尿病是由產生胰島素的胰腺β細胞的自身免疫性破壞引起的，而2型糖尿病的特征在于外周胰島素抵抗以及無法產生足夠的胰島素來克服這種抵抗。另外，與胰島素產生受損相關的不太常見的糖尿病形式包括妊娠糖尿病、青少年的成年發病型糖尿病、新生兒糖尿病和胰腺炎中的胰島缺失?；加?型糖尿病的患者接受注射外源胰島素治療，這可以在一定程度上控制血糖水平，并顯著降低糖尿病發病率，但這不是治愈性治療，并且與短期和長期并發癥有關。因此，雖然胰島素治療使無數糖尿病患者免于過早死亡，但它代表的是一種改善性治療，而不是治愈。

2、胰島，也稱為朗格漢斯島，是胰腺的含有其內分泌細胞的區域。該胰島在整個人體胰腺中按密度路徑排列，并且在葡萄糖的代謝中很重要。胰島產生的激素由(至少)五種類型的細胞直接分泌到血流中：

3、產生胰高血糖素的α細胞：產生胰島素和胰淀素的β細胞；產生生長抑素的δ細胞；產生胃饑餓素的ε細胞和產生胰多肽的pp細胞(γ細胞或f細胞)。胰島的細胞結構對于細胞-細胞通訊和協調的激素分泌至關重要。

4、糖尿病患者，尤其是患有1型糖尿病的患者，可以通過移植產生胰島素的胰腺貝塔細胞(β細胞)來治愈。從多能干細胞中產生無限供應的人β細胞可以為數百萬患者提供療法。因此，可以通過為有需要的患者補充丟失的β細胞來實現糖尿病的治愈。幾十年前，動物模型證明了這一途徑：通過注射同系胰島可以治愈因β細胞毒素鏈脲佐菌素而患上糖尿病的大鼠(參見murtaugh?2007的綜述)。衍生自人多能的胰腺祖細胞和/或胰島樣細胞聚集體的移植代表了有前途的治療糖尿病的方法。然而，需要可靠且安全的策略來獲得所需的細胞團塊，并依賴于有效的分化方案，這些方案可以擴大規模以滿足治療需求。

5、多能細胞(psc)，例如胚胎干細胞(esc)和誘導性多能干細胞(本文稱為ips細胞或ipsc)，具有分化為任何體細胞類型的能力，并且利用多能細胞的治療性潛力的可能性具有相當大的科學和公共利益。

6、過去十年中的許多不同研究已表明，可以從hpsc中生成胰腺細胞，包括表達多激素胰島素的細胞和表達單激素胰島素的細胞(us2019/0359943；us?10253298；us2011/0280842；nostro等人,(2015)；d’amour等人,(2006))。

7、然而，現有技術的方法沒有為胰腺β細胞提供臨床應用所需的效率和/或再現性。因此，需要替代方法來更有效地從多能細胞中衍生出所期望的細胞類型。充分利用干細胞的潛力面臨著重大挑戰，包括：(i)開發體外分化方法，這些方法確保生成特定所期望細胞類型的富集細胞群體；(ii)確保體外生成的細胞的身份和功能；以及(iii)消除可能破壞所期望細胞類型的功能的污染性非所期望細胞類型。培養物中存在不期望的細胞類型，包括例如多激素胰腺細胞，可能例如會在前景替代療法中帶來安全問題，或者可能對藥物篩選或疾病建模的結果產生負面影響。

8、因此，從本背景描述的不同部分可以明顯看出，提供所述克服所述缺點的差異化策略是期望的。

技術實現思路

1、作為本披露的目標是提供一種生成胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞的分化策略，該策略克服和/或減輕了當前策略的上述或其他缺點。

2、作為本披露的目標是提供一種有效且可重復的體外分化方案，用于產生胰腺譜系細胞(例如胰腺β細胞)，這些細胞表現出作為對葡萄糖刺激的應答產生胰島素的所期望能力。

3、作為本披露的目標是提供一種有效且可重復的體外分化方案，該方案允許大量產生胰腺內分泌譜系細胞，例如胰腺β細胞。

4、此外作為本披露的目標是提供一種體外分化方案，該方案允許獲得表現出高百分比的胰腺內分泌譜系細胞(例如胰腺單激素β細胞)和低百分比的污染細胞類型的培養物。

5、也作為本披露的目標是提供分化的細胞群體，其中高百分比的細胞表現出胰腺內分泌譜系細胞(例如胰腺β細胞)的功能特征。

6、作為本披露的目標是提供一種體外分化方案，該方案允許獲得高質量的胰島樣細胞聚集體，例如表現出高百分比的胰腺單激素β細胞和低百分比的污染細胞類型。所述胰島樣細胞聚集體還表現出單激素α細胞。也作為本披露的目標是提供表現出高百分比的胰腺內分泌譜系細胞(例如胰腺單激素β細胞)和低百分比的污染細胞類型的培養物。作為本披露的目標是提供高質量的胰島樣細胞聚集體，例如表現出高百分比的胰腺單激素β細胞和低百分比的污染細胞類型。所述胰島樣細胞聚集體還表現出單激素α細胞。特定地，所期望的細胞必須存活且健康。此類培養物可用于多種應用，包括治療性應用和科學應用/生物技術應用，例如體外藥物開發和篩選。例如，此類培養物可用于將細胞移植到有需要的患者體內。

7、對于技術人員來說，從本披露中顯而易見的這些和其他目標通過如所附權利要求中所要求的以及如本文中一般披露的本發明的不同方面來實現。

8、本文披露的用于從多能細胞分化胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞的方法涉及使用特定的培養條件，例如可溶性因子與環境條件和時間的組合，其引導非常高比例的多能細胞分化為期望的細胞命運的細胞。本披露基于以下令人驚訝的認識：在允許分化為胰腺祖細胞(pp)的條件下，后前腸細胞(pf)的短培養時間會產生更多數量的內分泌祖細胞(ep)(本文也稱為內分泌祖細胞)，即使獲得的pp細胞數量低于在培養時間較長的相應方法中的數量。本文中，術語“內分泌祖細胞”和“內分泌前體細胞”可互換使用。在不受理論束縛的情況下，似乎通過包括所述短培養時間的本發明方法獲得的pp細胞有能力發育/分化為ep細胞。重要的是，通過如本文所披露的方法獲得的ep細胞具有發育為成熟且有功能的胰腺β細胞的潛力。

9、因此，在本發明的第一方面，提供了一種用于生成胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞的方法，該方法包括以下的步驟a)-c)：

10、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

11、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；以及

12、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞。

13、為了澄清，步驟a)中提供的以表達pdx1為特征的后前腸細胞(pf)的細胞群體的細胞不表達nkx6.1，換言之，缺乏nkx6.1的表達。

14、因此，在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟a)中提供的后前腸細胞(pf)的細胞群體的特征在于pdx1的表達并且缺乏nkx6.1的表達。在一個實施方案中，步驟a)中提供的pf細胞的細胞群體的特征進一步在于hnf6的表達。因此，應理解，后前腸細胞的特征可以在于hnf6、pdx1的表達或pdx1和hnf6的共表達。

15、如本文所用，術語“分化”是指非特化(“未定向”)或特化程度較低的(“定向程度較低的”)細胞獲得特化細胞(“定向程度較高”)(諸如，例如胰腺細胞)特征的過程。分化的細胞是在細胞譜系中占據更特化(“定向”)位置的細胞。

16、如本文所用，術語“定向”在應用于分化過程時是指細胞在分化途徑中已經進行到在正常情況下會繼續分化為特定細胞類型或細胞類型子集，并且在正常情況下不能分化為不同的細胞類型或恢復到分化程度較低的細胞類型。

17、如本文所用，細胞的術語“譜系”是指細胞的遺傳性，即它來自哪些細胞以及它可以產生哪些細胞。細胞譜系將細胞置于體內或體外發育和/或分化的遺傳方案中。

18、如本文所用，術語“譜系特異性標志物”是指與目的譜系細胞的表型特定相關的特征，并且可被用于評估未定向細胞向目的譜系的分化。

19、本領域技術人員熟知胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)的不同發育階段。

20、如本文所用，術語“胰腺β細胞譜系”是指體內或體外發育和/或分化的遺傳方案，最終導致提供表現出胰腺單激素β細胞特征特性的細胞，例如胰島素的產生和pdx1、nkx6.1和neurod1中至少一種的表達。技術人員將理解，胰腺β細胞譜系細胞可以是所述細胞的早期發育階段的任何細胞。

21、如本文所用，術語“其前體”涉及胰腺譜系細胞，例如胰腺β細胞的前體，并且是指當在適合和/或允許前體細胞分化為胰腺譜系(例如胰腺β細胞的前體)的條件下培養時能夠分化為胰腺β細胞的任何細胞，包括例如多能干細胞、定形內胚層細胞、原始腸管細胞、后前腸細胞、胰腺祖細胞或內分泌祖細胞。

22、沿著胰腺β細胞譜系的細胞的分化包括從定向程度較低到定向程度較高的細胞類型的分化。簡而言之，產生胰島素的胰腺β細胞的發育代表了復雜發育程序的頂點，并涉及以下體內步驟：后前腸細胞獲得胰腺特性、擴增的胰腺原基采用內分泌命運，以及這些前體的子集變得有能力生成β細胞。已被證明在胰腺β細胞譜系細胞的發育中重要的因子(例如轉錄因子)除其他之外還包括pdx1(胰腺和十二指腸同源盒1)、ptf1a(胰腺特異性轉錄因子1a、ngn3(神經生成素3)、neurod1(神經源性分化1)和nkx6.1(同源盒蛋白nkx-6.1)。因子列表應被視為非限制性的，并且下面將討論另外的因子。

23、另外，沿著胰腺β細胞譜系的細胞發育需要來自外在因子(例如但不限于轉化生長因子-β(tgfβ)和視黃酸(ra))的信號傳導。最近的研究表明，tgfβ信號傳導誘導小鼠和人胚胎干(es)細胞中的定形內胚層，而ra治療促進es細胞衍生的內胚層中的pdx1表達和胰腺特化。技術人員理解，胰腺β細胞譜系細胞的體外分化需要在分化過程的適當階段并以合適/允許的濃度向細胞生長培養基添加外在因子，其原則上模擬所述細胞的體內發育。

24、因此，技術人員認識到，對于所列舉的細胞類型，“允許分化的條件”是指允許細胞表現出所述細胞類型的特征的條件，并且可以包括細胞培養基的組合、外在因子的存在和/或不存在及其時間設置。

25、以下是胰腺發育的各個發育階段的簡短總結。技術人員理解，所述發育可以按發育階段來描述。每個發育階段0-6的特征是一組因子(通常稱為標志物)的表達。

26、技術人員理解，將多能干細胞在體外分化為功能性胰腺內分泌細胞(例如單激素胰腺β細胞)的過程在一些方面可被視為進展通過六個連續階段，如圖1中所示的示意圖中所示，這些階段對應于體內發育階段。技術人員非常熟悉所述體內發育階段并且所述階段被認為涵蓋在本領域的公知常識內。

27、在這一逐步進展中，階段0是指未分化的hes細胞；階段1是指表達定形內胚層(de)細胞特征性標志物的細胞；階段2是指表達原始腸管細胞(pgt)特征性標志物的細胞；階段3細胞表達后前腸細胞(pf)特征性標志物；階段4是指表達胰腺祖細胞(pp)特征性標志物的細胞；階段5是指表達胰腺內分泌祖細胞(ep)特征性標志物的細胞；階段6是指表達內分泌胰島細胞特征性標志物的細胞，例如胰腺β細胞。如本文所定義的階段6細胞可以在形成體外胰島樣細胞聚集體(體外細胞聚集體)，其模擬體內發現的胰島。

28、技術人員理解，特定群體中并非所有細胞都以相同的速率進展通過這些階段，即，一些細胞可能比群體中存在的大多數細胞在分化途徑進展得更少或更多。

29、下面是與如上所述的體外培養的不同階段的細胞相關的特征的非詳盡描述。技術人員將理解體外培養的不同階段對應于體內的發育階段。技術人員應當理解，通過選擇性地選擇監測哪些蛋白質的表達，人們可以追蹤沿著胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)的發育進程。當需要時，可以評價發育階段的多于一個蛋白質特征的表達。隨著細胞在發育過程中的進展，某些蛋白質的表達被上調和下調，這使得所述蛋白質適合作為不同發育階段的標志物。

30、如本文所用，術語“定形內胚層細胞”是指表現出在原腸胚形成期間由外胚層產生并形成胃腸道及其衍生物的細胞的特征的細胞。定形內胚層細胞表達以下標志物中的至少一種、或兩種或全部三種：cxcr4、foxa2和sox17。因此，定形內胚層細胞可以通過以下標志物中的至少一種、或兩種或全部三種的表達來鑒定：cxcr4、foxa2和sox17。特定地，可以通過sox17的表達來鑒定定形內胚層細胞。

31、如本文所用，術語“原始腸管細胞”是指衍生自定形內胚層的細胞，其可產生所有內胚層器官，例如肺、肝、胰腺、胃和腸。原始腸管細胞表達以下標志物中的至少一種或兩種：hnf1β和hnf4α。因此，原始腸管細胞可以通過hnf1β、hnf4α或hnf1β和hnf4α兩者的表達來鑒定。

32、如本文所用，術語“后前腸細胞”是指產生胃、肝、胰腺、膽囊、和十二指腸的一部分的內胚層細胞。后前腸細胞表達pdx1或表達pdx1和hnf6兩者。因此，后前腸細胞可以通過pdx1、hnf6或pdx1和hnf6兩者的表達來鑒定。

33、如本文所用，術語“胰腺祖細胞”是指表達以下標志物中的至少一種、或兩種或三種或四種或五種或全部六種的細胞：pdx1、ptf1a、nkx6.1、sox9、cpa和hnf6。如圖1所示，胰腺祖細胞表達pdx1、nkx6.1、ptf1a和sox9。特定地，胰腺祖細胞共表達pdx1和nkx6.1。

34、因此，可以通過pdx1和nkx6.1的表達來鑒定胰腺祖細胞。胰腺祖細胞可以通過pdx1、nkx6.1、以及ptf1a和sox9之一或兩者的表達來鑒定。

35、如本文所用，術語“內分泌祖細胞”是指能夠變成胰腺激素表達型細胞的胰腺內胚層細胞。胰腺內分泌祖細胞表達以下標志物中的至少一種、或兩種、三種或全部四種：pdx1、nkx6.1、ngn3和neurod1。內分泌祖細胞可通過nxk6.1和neurod1的表達來鑒定。特定地，內分泌祖細胞與胰腺祖細胞的區別可能在于其表達neurod1和ngn3，而胰腺祖細胞不表達這兩者。內分泌祖細胞也可以通過以下的表達來鑒定：pdx1、nkx6.1和ngn3：或pdx1、nkx6.1和neurod1；或pdx1、nkx6.1、ngn3和neurod1。

36、如本文所用，術語“胰島細胞”是指能夠表達以下激素中的至少一種的細胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素、胃饑餓素和胰多肽。除了這些激素之外，胰腺內分泌細胞的特征性標志物還包括pdx1、nkx6.1和neurod1中的一種或兩種或全部三種。neurod1在大多數(例如基本上所有)內分泌胰島細胞中表達，而pdx1和nkx6.1對階段6的胰腺β細胞具有特異性。

37、如本文所用，術語“胰島樣細胞聚集體”或“胰島樣聚集體”是指胰腺細胞的細胞聚集體，其在體內顯示出胰島的特征。特定地，所述聚集體表現出以下的期望特性：高數量的單激素β細胞、期望數量的單激素α細胞、低數量的多激素細胞(包括低數量的多激素β細胞和低數量的多激素α細胞)、低數量的非內分泌細胞和低數量的增殖細胞。特定地，非常期望體外獲得的胰島樣細胞聚集體模擬體內胰島的特征，無論是在本文存在的細胞類型的分布方面還是在它們的功能特性方面。技術人員理解本文描述的百分比涉及胰島樣細胞聚集體表現出的平均百分比。因此，例如，分析100個聚集體，所述細胞類型的平均數量如本文所示。在該上下文中，下面列舉的特性是指根據本披露的胰島樣細胞聚集體群體中的平均百分比。

38、特定地，如本文所用，術語“胰腺β細胞”或“單激素胰腺β細胞”是指表達胰島素但不表達胰高血糖素或生長抑素的細胞。術語“胰腺β細胞”和“單激素胰腺β細胞”在本文中可互換使用。因此，胰腺單激素β細胞可以通過胰島素的表達和胰高血糖素和/或生長抑素表達的缺乏來鑒定。

39、胰腺β細胞是單激素細胞，換句話說，只表達一種激素，即胰島素。相反，胰腺細胞上下文中的多激素表達多于一種激素，例如胰島素、胰高血糖素和生長抑素中的至少兩種。

40、例如，如圖1所示，在上述發育階段的進展之后可以是標志物表達。例如，從階段0到階段1的進展與oct4、nanog和sox2表達的下調以及sox17、foxa和cxcr4表達的上調相關。從階段1到階段2的進展與hnf1β和hnf4α表達的上調相關。從階段2到階段3的進展與pdx1和hnf6表達的上調相關。

41、從階段3到階段4的進展與pdx1和hnf6表達的維持以及nkx6.1、ptf1a和sox9表達的上調相關。從階段4到階段5的進展與ptf1a和sox9表達的下調、pdx1和nkx6.1表達的維持以及ngn3和neurod1表達的上調相關。從階段5到階段6胰腺β細胞的進展與ngn3表達的下調、pdx1、nkx6.1和neurod1表達的維持以及胰島素和c肽表達的上調相關。因此，例如pdx1+細胞中nkx6.1的上調標志著進展到階段4。

42、技術人員應當理解，胰腺譜系細胞的發育進程可以被進一步劃分為另外的階段，例如基于標志物的表達水平。例如，在verhoeff及其同事的綜述文章(stem?cell?reviewsand?reports[干細胞綜述和報告](2022):18,2683-2698)中，總結了分化為胰島樣簇的七個階段，其中階段1-4和7對應于本技術中使用的階段1-4和6。根據verhoeff的階段5的特征在于nkx6.1的表達和ngn3的低表達，而根據verhoeff的階段6的特征在于ngn3的高表達和內分泌激素的表達。本披露中定義的階段5對應于verhoeff的階段5和階段6。

43、生成的細胞通過表型特征、形態特征和/或細胞標志物的表達來鑒定或表征，這些是在評價此類細胞的領域中的技術人員容易理解的。如本文所用，術語“標志物”指在目的細胞中差異表達的核酸或多肽分子。

44、本披露中討論的β細胞譜系標志物的非限制性實例包括：cxcr4、foxa2、sox17、hnf1β、hnf4α、pdx1、hnf6、pdx1、ptf1a、nkx6.1、sox9、ngn3、neurod1和胰島素。如上所述，所述標志物的組合是沿著β細胞譜系的不同發育階段的特征。如上所討論，技術人員應當理解，可以選擇標志物，使得標志物組合的表達或缺乏表達允許區分沿著胰腺內分泌譜系的不同發育階段的細胞(參見圖1)。發明人已使用不同標志物的表達來區分不同發育階段的細胞，如所附實施例中所例證的。如本文所用，當涉及細胞群體的細胞時，術語“以表達……為特征”應被解釋為與給定標志物或標志物組的表達相關。相反，當涉及細胞群體的細胞時，術語“特征在于缺乏……的表達”或“缺乏……的表達”或“不表達……”應被解釋為與給定標志物或標志物組的表達缺失相關。技術人員非常熟悉使用標志物表達作為區分具有不同特征的細胞(例如胰腺β細胞譜系的不同發育階段的細胞)的方式。

45、技術人員應當理解，當通過在可同時評分的標志物的數量方面受到限制的方法分析細胞群體時，例如由于方法本身的限制或由于所使用的試劑的限制，可以選擇允許區分第一細胞群體和第二細胞群體的標志物子集。例如，以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞的細胞群體可以與以表達pdx1、nkx6.1、neurod1和ngn3為特征的內分泌祖細胞的群體區分開。例如，胰腺祖細胞對pdx1或nkx6.1呈陽性，而對ngn3或neurod1之一呈陰性。ep細胞可以被評分為nkx6.1和至少一種不由胰腺祖細胞表達的標志物的雙陽性，例如nkx6.1和neurod1的雙陽性；或nkx6.1和ngn3的雙陽性。實施例部分應用了這一原理來區分具有不同特征的細胞。重要的是，如果用上面列出的其他標志物對所述細胞進行評分，則所述細胞將表現出特定群體的完整標志物譜。在實驗設置中僅使用標志物子集的事實決不能被解釋為代表剩余特征性標志物的表達的缺乏。技術人員將理解，可以在核苷酸水平，例如mrna水平或蛋白質水平評價標志物表達。評價標志物表達的眾所周知的方法包括但不限于免疫組織化學、原位雜交、facs、rna測序、陣列(例如微陣列)的使用以及定量pcr。技術人員知道這些和其他合適的方法。

46、在該上下文中，差異表達意指與未分化細胞或處于不同發育階段的細胞相比，陽性標志物的水平增加以及陰性標志物的水平降低。與其他細胞相比，目的細胞中標志物核酸或多肽的可檢測水平足夠高或低，使得可以使用本領域已知的多種方法中的任一種來鑒定目的細胞并將其與其他細胞區分開。

47、如本文所用，當在細胞中充分檢測到特定標志物(換言之，由該細胞表達)時，細胞對于特定標志物呈“陽性(positive?for)”，或者是“陽性(positive)”。因此，以給定標志物的表達為特征的細胞對于所述標志物是陽性的。相反，當在細胞中沒有充分檢測到特定標志物時，細胞對于特定標志物呈“陰性”，或者是“陰性”。因此，以缺乏給定標志物的表達為特征的細胞對于所述標志物是陰性的。與標志物相關的“+”或“-”號的使用在本文中意在理解為對所述標志物呈陽性或陰性(例如nkx6.1+細胞對標志物nkx6.1呈陽性)。

48、使用任何體外分化方法，獲得包含在給定時間點表現出相同或相似特性的細胞的群體的能力至關重要，因為處于不同發育、成熟或功能階段的細胞可能對外部和內部信號有不同的應答。為了澄清，因子x可能在發育期間導致細胞類型a和b的特化，而用相同的因子x處理可能導致成熟細胞類型a的選擇性細胞死亡。因此，不僅了解使細胞經受給定因子的下游功能結果很重要，在所述細胞能夠以期望的方式應答于所述因子的時間窗口期間使該細胞經受所述因子同樣重要。因此，技術人員應當理解獲得同步細胞群體的重要性，以確保該細胞群體作為整體的期望應答。例如，期望的是需要培養物中的大多數細胞在給定時間點是祖細胞。

49、在如本文所披露的第一方面的一個實施方案中，提供了一種方法，其中在步驟b)中，將所述細胞群體培養不超過大約75小時，例如不超過大約72小時，例如不超過大約66小時，例如不超過大約60小時，例如不超過大約48小時。在另一個實施方案中，提供了一種方法，其中在步驟b)中，將所述細胞群體培養大約42至78小時的時間段，例如大約44至76小時的時間段，例如大約46至74小時的時間段，例如大約48至72小時的時間段。在一個實施方案中，將所述細胞群體培養大約40至78小時的時間段，例如大約42至76小時的時間段，例如大約44至74小時的時間段，例如大約48至72小時的時間段。在一個實施方案中，將所述細胞群體培養大約42至54小時的時間段，例如大約44至52小時的時間段，例如大約46至50小時的時間段，例如約48小時的時間段。

50、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟c)中的胰腺祖細胞的細胞群體，例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞的細胞群體，進一步以表達選自由以下組成的組的至少一種標志物為特征：ptf1a、sox9、hnf6和cpa，例如選自由以下組成的組的標志物：sox9和ptf1a。在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟c)中的胰腺祖細胞的細胞群體進一步以表達ptf1a和sox9為特征。

51、如上所討論，“允許分化的條件”是指允許細胞表現出所述細胞類型的特征的條件，并且可以包括細胞培養基的組合、外在因子的存在和/或不存在及其時間設置。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基是適合于在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養后前腸細胞的培養基。階段4(s4)培養基的非限制性實例如所附實施例中所定義。步驟b)中的所述培養基可以補充有如本文所規定的其他因子。技術人員理解可以使用其他合適的培養基。特定地，在如本文所披露的步驟b)中允許分化為胰腺祖細胞的條件下的培養可以涉及在存在特定外在因子的情況下在培養基中培養細胞群體，這些外在因子是例如表皮生長因子(egf)和煙酰胺(nic)或其衍生物或激動劑。因此，在如本文所披露的方法的一個實施方案中，允許分化為胰腺祖細胞的條件包括在存在有效量的表皮生長因子(egf)(例如人egf或其衍生物或激動劑)；以及有效量的煙酰胺(nic)或其衍生物或激動劑的情況下在培養基中培養所述細胞群體。在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟b)包括在存在有效量的egf(例如人egf)和有效量的nic的情況下在培養基中培養所述細胞群體。

52、表皮生長因子(egf)是一種通過與其受體egfr結合來刺激細胞生長和分化的蛋白質。人egf是6-kda蛋白質，具有53個氨基酸殘基和3個分子內二硫鍵。與受體的結合刺激配體誘導的二聚化，激活內在的蛋白酪氨酸激酶活性，從而啟動信號轉導級聯，該信號轉導級聯導致細胞內的各種生化變化—細胞內鈣水平升高、糖酵解和蛋白質合成增加，以及包括egfr基因的某些基因表達增加—最終導致dna合成和細胞增殖。egf是egf蛋白質家族的成員。該蛋白質家族的成員具有高度相似的結構和功能特征。除了egf本身之外，其他家族成員還包括肝素結合egf樣生長因子(hb-egf)、轉化生長因子-α(tgf-α)、雙調蛋白(ar)、上皮調節蛋白(epr)、epigen、乙胞素(btc)、神經調節蛋白-1(nrg1)、神經調節蛋白-2(nrg2)、神經調節蛋白-3(nrg3)和神經調節蛋白-4(nrg4)。

53、技術人員應當理解，如本文所用，術語“表皮生長因子(egf)或其衍生物或激動劑”意在包括增強或替代egf信號傳導的因子。這些因子可能參與egf下游的信號傳導或者是小分子激動劑。egf衍生物或激動劑的非限制性列表包括高親和力egfr配體例如tgf-α、btc和hb-egf，以及低親和力配體例如ar、epr和epigen。因此，在本方面的一個實施方案中，所述egf或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：egf、tgf-α、btc、hb-egf、ar、epr和epigen，例如是egf。在一個特定實施方案中，所述egf是人egf。

54、煙酰胺(nic)，也稱為nam，是維生素b的一種形式。煙酰胺的結構由吡啶環組成，該吡啶環間位附接有伯酰胺基團，并且該伯酰胺基團是煙酸的酰胺。煙酰胺是眾所周知的細胞培養補充劑，用于在胚胎干細胞和誘導性多能干細胞的分化中使用，并已被證明在各種應用中調節干細胞分化，包括胰腺細胞的分化。技術人員應當理解，如本文所用，術語“煙酰胺(nic)或其衍生物或激動劑”意在包括增強或替代nic信號傳導的因子。此類衍生物或激動劑的非限制性實例包括nic、尼克酸(煙酸)、煙酰胺核苷、nad/nadp以及作為nic前體的色氨酸。因此，在本方面的一個實施方案中，所述nic或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：nic、尼克酸、煙酰胺核苷、nad/nadp和色氨酸，例如其中所述nic或其衍生物或激動劑是nic。

55、在所述方法的一個實施方案中，所述egf或其衍生物或激動劑的有效量是大約50至200ng/ml，例如大約50至150ng/ml，例如大約75至125ng/ml，例如大約100ng/ml

56、在所述方法的一個實施方案中，所述nic或其衍生物或激動劑的有效量是大約5nm-20nm，例如大約5mm至15mm，例如大約8mm至12mm，例如大約10mm。

57、如本文所披露的方法的步驟b)可包括在培養基中培養細胞群體，該培養基包含另外的因子，例如一種或多種選自以下的因子：kgf及其衍生物和激動劑；acta及其衍生物和激動劑；視黃酸及其衍生物和激動劑；sant-1及其衍生物和激動劑；pdbu及其衍生物和激動劑；以及ldn及其衍生物和激動劑，例如選自kgf、acta、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的多種因子中的一種。在一個實施方案中，所述步驟b)包括在培養基中培養所述細胞群體，該培養基還包含以下：kgf或其衍生物或激動劑；acta或其衍生物或激動劑；視黃酸或其衍生物或激動劑；sant-1或其衍生物或激動劑；pdbu或其衍生物或激動劑；以及ldn或其衍生物或激動劑，例如還包含kgf、acta、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的培養基。應當理解，培養基可以包含因子及其衍生物和/或激動劑的混合物。

58、技術人員應當理解，細胞培養基和其中包含的因子可以通過用它們的衍生物和/或激動劑(例如用下文描述的那些)替換因子來調整。

59、角質形成細胞生長因子(kgf)，也稱為成纖維細胞生長因子7(fgf7)，是fgf蛋白家族的成員。它是一種生物活性蛋白，常用于細胞培養應用。kgf與成纖維細胞生長因子受體2b(fgfr2b)結合。kgf誘導許多上皮細胞增殖，但不誘導成纖維細胞和內皮細胞增殖，它是皮膚角質形成細胞的主要生長因子，且也用于在多能細胞的培養和分化中使用。技術人員將理解，kgf可以在本文所述的細胞培養中被其衍生物或激動劑替代。此類激動劑的非限制性實例包括結合fgfr2b并通過所述受體(例如fgf10)發出信號的其他因子。

60、在一個實施方案中，所述kgf或其衍生物或激動劑選自由kgf和fgf10組成的組，例如是fgf10。

61、在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含25ng/ml至75ng/ml?kgf或其衍生物或激動劑，例如50ng/ml?kgf或其衍生物或激動劑。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約25ng/ml至75ng/ml的kgf，例如大約50ng/ml的kgf。

62、acta或激活素a是tgf-β超家族的成員。激活素以及nodal配體都可以通過相同的受體和效應子發出信號以調節轉錄。在許多情況下，nodal和激活素介導的信號傳導的效果是難以區分的；因此，它們被稱為激活素/nodal。激活素/nodal與ii型激活素受體(actrii/iib)結合，導致i型激活素受體(激活素受體樣激酶，或alk，包括alk1-7)，特別是alk4的募集、磷酸化和激活。然后絲氨酸/蘇氨酸激酶受體actrii/iib和alk4/7觸發smad轉錄因子smad2和smad3的磷酸化。

63、本領域已知tgfβ信號傳導參與胚胎發生、細胞分化和凋亡以及其他功能。激活素/nodal和tgfβ通路共享下游效應子smad2和smad3。

64、據報道，激活素/nodal參與維持干細胞的多能性，然而激活素/nodal信號傳導也是內胚層分化所必需的。

65、技術人員將理解，acta可以在本文所述的細胞培養中被其衍生物或激動劑替代。此類激動劑的實例包括通過所述受體發出信號的nodal、下游效應分子(例如smad?2和3)以及通過相同效應子分子發出信號的tgfβ。另外的其衍生物或激動劑包括但不限于tgfβ1-3(tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3)nodal、激活素a、gdf-1、gdf-8、gdf-11，它們均激活smad2/3/4復合物。

66、在一個實施方案中，所述acta或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：acta和gdf-8、nodal、tgfβ1-3(tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3)。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約1至10ng/ml，例如2.5至7.5ng/ml的acta，例如大約5ng/ml的acta。

67、視黃酸(ra)是維生素a的代謝物，并介導生長發育所需的維生素a的功能。已知視黃酸參與指定沿胚胎前后軸的位置，也稱為模式形成，并且還已知在胰腺發育的較后階段發揮作用，以促進胰腺內分泌祖細胞的生成及其分化為胰島和β細胞。

68、視黃酸通過與視黃酸受體(rar)結合發揮作用，該視黃酸受體與類視黃醇x受體(rxr)作為異二聚體在稱為視黃酸應答元件(rare)的區域中與dna結合。視黃酸配體與rar的結合改變了rar的構象，從而影響了誘導或抑制附近基因轉錄的其他蛋白質的結合。技術人員將理解術語“視黃酸或其衍生物或激動劑”在本文中意在包括增強或替代視黃酸信號傳導的因子。這些因子可能參與視黃酸下游的信號傳導或者是小分子激動劑。視黃酸衍生物或激動劑的非限制性列表包括全反式視黃酸、合成類視黃醇ec23、ch55、ttnpb、芬維a胺、rar激動劑(例如rara激動劑和rarb激動劑ac261066)、阿達帕林、ac55649、am80、am580、bms753、他扎羅汀和ro?41-5253。因此，在本方面的一個實施方案中，所述視黃酸或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：視黃酸、全反式視黃酸、合成類視黃醇ec23、ch55、ttnpb、芬維a胺、rar激動劑(例如rara激動劑和rarb激動劑ac261066)、阿達帕林、ac55649、am80、am580、bms?753、他扎羅汀、ro?41-5253。

69、在一個實施方案中，所述視黃酸(ra)或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：視黃酸、全反式視黃酸和合成類視黃醇ec23。在一個實施方案中，所述視黃酸或其衍生物或激動劑選自由視黃酸和全反式視黃酸組成的組。在一個實施方案中，所述視黃酸或其衍生物或激動劑是全反式視黃酸。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約50nm至150nm的ra或其衍生物或激動劑，例如大約100nm的ra或其衍生物或激動劑。

70、在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約50nm至150nm的ra，例如大約100nm的ra。

71、已知刺猬(hedgehog)(hh或hh)信號傳導在調節脊椎動物器官發生中發揮關鍵作用，例如在四肢指(趾)的生長和腦的組織中。脊椎動物刺猬蛋白家族由音猬因子(shh)、印度刺猬因子(ihh)和沙漠刺猬因子(dhh)組成，它們通過類似的通路發出信號并共享許多功能特征。胰腺發育的關鍵負調節因子是音猬因子(shh)，因此在胰腺發育開始時抑制shh非常重要，并且必須維持刺猬抑制以確保胰腺正常發育。

72、簡而言之，hh通過與包含以下兩種組分的hh受體復合物相互作用來發出信號：補丁(patched)(ptc)和平滑(smoothened)(smo)，其將hh信號轉導到細胞中。ptc被認為通過與細胞膜中的smo結合來抑制hh信號傳導。當hh配體存在時，這種抑制被解除，smo能夠發出信號。在脊椎動物中，鋅指蛋白gli1、gli2和gli3是hh信號傳導的下游介質，并以hh依賴性方式參與控制靶基因的轉錄應答。

73、sant-1是刺猬(hh)信號傳導的抑制劑，并且通過拮抗平滑(smoothened)活性發揮作用。刺猬信號傳導抑制劑的非限制性實例包括環巴胺、ihr?1、ihr-cy3、伊曲康唑、蒜藜蘆堿、m?25、mrt?10、pf?04449913馬來酸鹽、pf?5274857鹽酸鹽、sant-1和sant-2。

74、在一個實施方案中，所述sant-1或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：環巴胺、ihr?1、ihr-cy3、伊曲康唑、蒜藜蘆堿、m?25、mrt?10、pf?04449913馬來酸鹽、pf?5274857鹽酸鹽、sant-1和sant-2。

75、在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約0.10μm至0.50μm的sant-1，例如大約0.25μm的sant-1。

76、pdbu(佛波醇-12,13-二丁酸酯)是一氧化氮(no)合成的強促進劑和蛋白激酶c的有效激活劑。據報道，pdbu是腫瘤促進劑，其激活多種細胞應答，包括增殖?？梢杂玫鞍准っ竎的其他激活劑(例如但不限于佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)或tppb)替代pbdu。在一個實施方案中，所述pdbu或其衍生物或激動劑選自由pdbu、pma和tppb組成的組。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約0.25μm至0.75μm的pdbu，例如約0.5μm的pdbu。

77、ldn193189(本文中稱為ldn)是骨形態發生(bmp)抑制劑，并且通過抑制alk2和alk3發揮作用。ldn主要通過阻止smad1、smad5和smad8磷酸化發揮作用。ldn是多索莫芬(dorsomorphin)和noggin的類似物，多索莫芬可能會替代ldn。在一個實施方案中，所述ldn或其衍生物或激動劑選自由ldn、noggin和多索莫芬組成的組。在一個實施方案中，步驟b)中的所述培養基包含大約100nm至300nm的ldn，例如100nm-250nm的ldn，例如150nm-250nm的ldn，例如大約200nm的ldn。

78、在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟b)包括在培養基中培養細胞群體，該培養基包含大約50ng/ml?kgf、大約5ng/ml?acta、大約100nm視黃酸、大約0.25mmsant-1、大約500nm?pdbu、大約200nm?ldn、大約100ng/ml?egf和大約10mm?nic。

79、組織工程改造、干細胞和分子生物學研究主要涉及在平坦塑料或玻璃皿/細胞培養板上進行細胞培養。這些培養被認為是貼壁培養。該技術稱為二維(2d)細胞培養。如本文所用，在細胞培養上下文中的術語“2d”是指在平坦的細胞培養板上培養，其中這些細胞直接或間接(例如經由細胞培養基底)粘附至所述培養板。板可以包被有細胞培養基底。細胞培養基底主要有兩大類：天然存在的和合成的。最常用的天然基底是膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白，它們構成胞外基質的一部分。細胞通過細胞表面受體(例如整合素)與這些基質組分相互作用。受體與膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白的結構域結合，并觸發促進粘附復合物形成的胞內信號傳導通路，并且還可能觸發細胞增殖或分化。2d培養最常見的合成基底包括聚賴氨酸，一種含有帶正電荷的氨基基團的賴氨酸聚合物?；椎倪x擇對細胞生長和附著的方式有很大影響，因此是需要考慮的重要參數。

80、在本文披露的方法的一個實施方案中，細胞在步驟b)中在2d基底上培養。在一個實施方案中，所述細胞粘附于所述2d基底。所述2d基底可包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白及其片段、明膠及其片段、官能化絲(fn絲)、以及基質膠(matrigel)tm，例如可包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白、明膠、以及基質膠tm，例如可包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、以及基質膠tm，例如可包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、以及基質膠tm。特定地，所述片段可以包含蛋白質的功能結構域。因此，技術人員應當理解，片段可對應于功能結構域或包含功能結構域，例如包含功能結構域并且進一步包含另外的n末端和/或c末端氨基酸。matrigeltm衍生自小鼠engelbreth-holm-swarm腫瘤，并且含有許多未知組分。已知層粘連蛋白是基質膠的主要組分。除了使用確定的培養基之外，避免使用任何動物衍生產品可能是有益的，特別是對于用于治療性用途的細胞培養物而言，以獲得確定的和可重復的產品并避免任何潛在的患者安全性問題。如本文所用，官能化絲是指包含絲蛋白和細胞結合基序的重組融合蛋白。在某些實施方案中，所述官能化絲包含選自以下的細胞結合基序：rgd、ikvav(seq?id?no:1)、yigsr(seq?idno:2)、epdim(seq?id?no:3)、nkdil(seq?id?no:4)、grkrk(seq?id?no:5)、kygaasikvavsadr(seq?id?no:6)、ngeprgdtyray(seq?id?no:7)、pqvtrgdvftm(seq?id?no:8)、avtgrgdspass(seq?id?no:9)、tgrgdspa(seq?id?no:10)、ctgrgdspac(seq?id?no:11)和c1x1x2rgdx3x4x5c2(seq?id?no:12)，優選選自c1x1x2rgdx3x4x5c2、grkrk、ikvav、rgd和ctgrgdspac，其中x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自除半胱氨酸以外的天然氨基酸殘基；并且c1和c2通過二硫鍵連接。

81、在一個特定實施方案中，所述官能化絲包含蛛絲蛋白片段和細胞結合基序，該細胞結合基序被定義為包含氨基酸序列c1x1x2rgdx3x4x5c2(seq?id?no:12)，其中x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自除半胱氨酸以外的天然氨基酸殘基；并且c1和c2通過二硫鍵連接。

82、官能化絲已在wo?2016/207281和wo?2017/137611中進行了描述，并且這些披露以其整體包含在本文中。特定地，所述官能化絲可以是包含以下氨基酸序列的重組多肽：

83、c1x1x2rgdx3x4x5c2(seq?id?no:12)，其中

84、x1是s或t；

85、x2是g、a或v；

86、x3是s或t；

87、x4是g、a、v或p；以及

88、x5是g、a或v；以及

89、c1和c2通過二硫鍵連接；

90、并且其中該蛛絲蛋白片段包含蛋白質部分rep和ct，其中rep是具有70至300個氨基酸殘基的重復片段，選自由以下組成的組：l(ag)nl、l(ag)nal、l(ga)nl和l(ga)ngl，其中n是2至10的整數；

91、每個單獨的a段是具有8至18個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中0至3氨基酸殘基不是ala，其余的氨基酸殘基是ala；每個單獨的g段是具有12至30個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸25殘基是gly；每個單獨的l段是具有0至30個氨基酸殘基的接頭氨基酸序列；并且ct是具有70至120個氨基酸殘基的片段，與srlsspsavsrvssavsslvsngqvnmaalpniis?nisssvsasapgasgcevivqallevitalvqivssssvgyinpsavnqitnvva?namaqvmg(seq?id?no:13)具有至少70％的同一性。在一個實施方案中，ct片段與seq?id?no:13具有至少70％，比如至少80％、比如至少85％，優選至少90％，比如至少95％的同一性。在某些實施方案中，蛛絲蛋白片段與seq?id?no:16或與seq?id?no:14的氨基酸殘基18-277具有至少70％，例如至少80％，例如至少85％，優選至少90％，例如至少95％的同一性。在特定實施方案中，所述細胞結合基序包含氨基酸序列ctgrgdspac(seq?id?no:11)。

92、在特定實施方案中，所述官能化絲包含選自由seq?id?no:14和seq?id?no:15組成的組的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述官能化絲與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少70％，例如至少80％，例如至少85％，優選至少90％，例如至少95％的同一性：seq?id?no:14和seq?id?no:15。

93、因此，在一個實施方案中，所述2d基底不包含任何動物衍生的組分。在一個實施方案中，所述2d基底不是基質膠tm。換句話說，所述2d基底的組分可以是利用重組技術產生的組分。

94、因此，在一個實施方案中，所述2d基底可包含以下或由以下組成：層粘連蛋白(ln)及其片段，例如重組產生的層粘連蛋白(ln)及其片段。

95、層粘連蛋白是胞外基質的高分子量蛋白質。它們是基膜的主要組分，基膜是大多數細胞和器官的蛋白質網絡基礎。層粘連蛋白是基膜的重要且具有生物活性的部分，影響細胞分化、遷移和粘附。因此，選擇用作細胞培養基底的層粘連蛋白很重要，以便為細胞提供適當的化學和機械敏感微環境，從而提供最佳的培養條件。

96、每個層粘連蛋白同種型由三個相互螺旋的鏈-α、β和γ鏈組成，這些鏈分別以五種、四種和三種遺傳上不同的變體存在。層粘連蛋白同種型根據其鏈組成來命名。例如，α5鏈、β2鏈和γ1鏈的組合形成層粘連蛋白5-2-1(ln-521)。三聚體蛋白形成十字形結構，其可以與其他胞外基質分子和各種細胞膜受體結合。

97、因此，用作2d基底的層粘連蛋白或其片段的選擇很重要并且將受到培養的細胞類型的影響。此外，細胞系之間的差異(例如不同的es或ips細胞系或原代細胞)可能會影響最佳2d基底的選擇。全長層粘連蛋白可用作細胞培養基底，然而其片段也可用于細胞培養。已鑒定出層粘連蛋白的不同結構域，其介導不同的活性，例如細胞附著以及對細胞增殖、分化和運動的影響。

98、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、ln-121及其片段、以及ln-111及其片段；例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、以及ln-121及其片段；例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、以及ln-332及其片段；例如由ln-521及其片段組成的組或由ln-511及其片段組成的組。

99、在一個實施方案中，所述層粘連蛋白及其片段選自由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421、ln-121和ln-111；例如由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421和ln-121，例如由以下組成的組：ln-521、ln-511和ln-332；例如由以下組成的組：ln-521和ln-511；例如其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-521或例如其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-511。

100、已知的是層粘連蛋白e8片段，其是由α、β和γ鏈的c末端區域組成的截短的蛋白質。這些層粘連蛋白片段含有活性整合素結合位點，該位點包含α鏈的層粘連蛋白球狀1-3結構域和γ鏈的c末端尾部中的谷氨酸殘基，但缺乏其他活性，例如與全長層粘連蛋白相關的肝素/硫酸乙酰肝素結合活性。e8片段代表功能上最小的形式，該形式保留了與α6β1整合素結合的全部能力。在一個實施方案中，所述一個或多個其片段是e8片段。

101、因此，在一個實施方案中，所述層粘連蛋白及片段包含層粘連蛋白的e8片段，例如選自由以下組成的組的e8片段：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、ln-421的e8片段、ln-121的e8片段和ln-111的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、以及421的e8片段和ln-121的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段和ln-332的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段和ln-521的e8片段；例如ln-511的e8片段或ln-521的e8片段。

102、如上所述，本披露基于以下令人驚訝的認識：與具有較長培養時間的相應方法相比，在允許分化為胰腺祖細胞(pp)的條件下，后前腸細胞(pf)的短培養時間會產生更多數量的內分泌祖細胞(ep)，即使獲得的pp細胞數量低于在具有較長培養時間的相應方法中的數量。

103、因此，在本方面的一個實施方案中，提供了一種方法，其中a)中的至少大約70％，例如至少大約75％，例如至少大約80％的后前腸細胞分化為c)中的胰腺祖細胞。

104、在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的至少大約80％，例如大約80％至85％，例如大約80％至90％表達pdx1。在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的至多大約10％，例如至多大約8％，例如至多大約7％，例如至多大約5％，例如至多大約3％表達neurod1。在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的至多大約10％，例如至多大約8％，例如至多大約7％，例如至多大約5％，例如至多大約3％表達neurod1且不表達nkx6.1。在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的大約25％至50％，例如大約25％至48％，例如大約25％至45％表達nkx6.1。在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的大約30％至50％，例如大約35％至45％，例如大約40％至45％表達nkx6.1。在一個實施方案中，在步驟c)中，大約至少大約40％，例如至少大約50％，例如至少大約60％的細胞不表達neurod1和nkx6.1。

105、在一個實施方案中，所述后前腸細胞的特征在于a)中pdx1的表達并且缺乏nkx6.1的表達。

106、在如本文所披露的方法的另一個實施方案中，該方法在步驟a)-c)之前包括步驟a-1)-c-1)

107、a-1)提供原始腸管細胞的細胞群體，這些原始腸管細胞是例如以表達hnf1β和/或hnf4α為特征的原始腸管細胞；

108、b-1)在允許分化為后前腸細胞的條件下培養所述原始腸管細胞的細胞群體不超過大約54小時；以及

109、c-1)從而生成后前腸細胞的群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞。

110、應當理解，后前腸細胞的特征同樣可以在于hnf6的表達或pdx1和hnf6的共表達。

111、如本文所用，每個方法步驟都用字母代碼表示，例如a)、b)、c)等。在適當的條件下培養某個發育階段的細胞群體以使其分化為下一個發育階段的群體的完整方法組包括步驟a)、b)、c)等。每個步驟還可以由帶有相關數字指示符的字母代碼來表示。數字指示符指示完整方法組中的每個步驟在培養后前腸細胞(pf)以生成胰腺祖細胞(pp)的完整方法組之前(負數字指示符)或之后(正數字指示符)。為了說明與在適當條件下培養某個發育階段的細胞群體以允許其分化為下一個發育階段的群體的完整方法組相關的方法步驟，示于下表1中：

112、

113、表1.方法組和步驟的總結。

114、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟a-1)中提供的原始腸管細胞的細胞群體以表達hnf1β、hnf4α或hnf1β和hnf4α兩者為特征。

115、在一個實施方案中，所述后前腸細胞的群體以表達pdx1或hnf6為特征。在一個實施方案中，所述后前腸細胞的群體以表達pdx1和hnf6為特征。在本文披露的方法的一個實施方案中，步驟c-1)中的后前腸細胞的細胞群體的特征在于pdx1的表達并且缺乏nkx6.1的表達。

116、在一個實施方案中，c-1)中的所述后前腸細胞的群體的特征在于pdx1和hnf6的表達并且缺乏nkx6.1的表達。所述后前腸細胞的群體不表達nkx6.1、ptf1a和sox9。

117、在不受理論束縛的情況下，設想在允許分化為后前腸細胞的條件下培養所述原始腸管細胞的細胞群體的步驟b-1)不超過54小時是有益的，以便獲得有能力發育為β細胞譜系較后階段的后前腸細胞的群體。據設想，在允許分化為后前腸細胞的條件下培養比54小時更長的時間段的原始腸管細胞不太有能力發育為β細胞譜系的較后階段。在如本文所披露的方法的一個實施方案中，將步驟b-1)中的細胞群體培養不超過大約52小時，例如不超過大約50小時，例如不超過大約48小時，例如不超過大約44小時，例如不超過大約40小時，例如不超過大約36小時，例如不超過大約32小時，例如不超過大約28小時，例如不超過大約26小時，例如大約24小時。

118、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，將步驟b-1)中的細胞群體培養大約18至54小時的時間段，例如大約20至52小時的時間段，例如大約22至50小時的時間段，例如大約24至48小時的時間段。在一個實施方案中，將步驟b-1)中的細胞群體培養大約42至54小時的時間段，例如大約44至52小時的時間段，例如大約46至50小時的時間段，例如大約48小時。在一個實施方案中，將步驟b-1)中的細胞群體培養大約18至30小時的時間段，例如大約20至28小時的時間段，例如大約22至26小時的時間段，例如大約24小時。

119、如上所討論，“允許分化的條件”是指允許細胞發育/分化以表現出所述細胞類型的特征的條件，并且可以包括細胞培養基的組合、外在因子的存在和/或不存在及其時間設置。所述因子以及它們的衍生物和激動劑已經關于上面的步驟b)詳細討論，并且僅為了簡潔起見此處將不再重復所述討論。因此，在一個實施方案中，提供了一種方法，其中步驟b-1)包括在包含一種或多種選自以下的因子的培養基中培養所述細胞群體：kgf及其衍生物和激動劑；視黃酸及其衍生物和激動劑；sant-1及其衍生物和激動劑；pdbu及其衍生物和激動劑；以及ldn及衍生物和激動劑，例如選自kgf、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的一種或多種因子。在一個實施方案中，所述步驟b-1)包括在培養基中培養所述細胞群體，該培養基包含一種或多種選自kgf及其衍生物和激動劑以及視黃酸及其衍生物和激動劑的因子，例如一種或多種選自kgf和視黃酸的因子，例如kgf和視黃酸兩者。在一個實施方案中，所述步驟b-1)包括在培養基中培養所述細胞群體，該培養基包含以下：kgf或其衍生物或激動劑；視黃酸或其衍生物或激動劑；sant-1或其衍生物或激動劑；pdbu或其衍生物或激動劑；以及ldn或其衍生物或激動劑，例如包含kgf、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的培養基。應當理解，培養基可以包含因子及其衍生物和/或激動劑的混合物。

120、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基是適合于在允許分化為后前腸細胞的條件下培養原始腸管細胞的培養基。階段3(s3)培養基的非限制性實例如本實施例中所定義。技術人員理解可以使用其他合適的培養基。步驟b-1)中的所述培養基可以補充本文指定的其他因子。

121、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含25ng/ml至75ng/ml?kgf或其衍生物或激動劑，例如50ng/ml?kgf或其衍生物或激動劑。在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約25ng/ml至75ng/ml的kgf，例如大約50ng/ml的kgf。在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約1μm至3μm的ra，例如大約2μm的ra。

122、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約0.10μm至0.50μm的sant-1，例如大約0.25μm的sant-1。

123、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約250nm至750nm的pdbu，例如大約500nm的pdbu。

124、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約100nm至300nm的ldn，例如100nm-250nm的ldn，例如150nm-250nm的ldn，例如大約200nm的ldn。

125、在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟b-1)包括在包含大約50ng/mlkgf、大約2μm視黃酸、大約0.25μm?sant-1、大約500nm?pdbu和大約200nm?ldn的培養基中培養細胞群體。

126、在如本文所披露的方法的另一個實施方案中，該方法在步驟a)-c)之后包括步驟a+1)-c+1)

127、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞；

128、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

129、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達neurod1為特征、例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

130、在一個實施方案中，所述內分泌祖細胞的群體的特征還在于表達nkx6.1和ngn3中的至少一種。技術人員應當理解，兩種標志物的不同組合同樣可以用于內分泌祖細胞，例如nkx6.1和ngn3、nkx6.1和neurod1、或nkx6.1和ngn3，以便將該細胞與胰腺祖細胞區分開。例如，步驟c+1)中的內分泌祖細胞的群體的特征可以在于以下的表達：pdx1、nkx6.1和neurod1；pdx1、nkx6.1和ngn3；或pdx1、nkx6.1、neurod1和ngn3。應當理解，pdx1+/nkx6.1+細胞(換言之，對pdx1和nkx6.1兩者均呈陽性的細胞)中ngn3或neurod1的表達指示胰腺祖細胞采取內分泌祖細胞命運。技術人員理解，由于染色方案的實驗限制，可以評價針對pdx1或nkx6.1染色的細胞的ngn3或neurod1的表達。在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟c+1)中的內分泌祖細胞的細胞群體以表達以下為特征：pdx1、nkx6.1和neurod1；pdx1、nkx6.1和ngn3；或pdx1、nkx6.1、neurod1和ngn3。

131、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟a+1)中提供的胰腺祖細胞的細胞群體以表達pdx1和nkx6.1為特征，換言之，pdx1和nkx6.1的共表達。在另一個實施方案中，步驟a+1)中的所述胰腺祖細胞的細胞群體的特征進一步在于標志物ptf1a、sox9和hnf6中的一種或多種的表達，例如標志物ptf1a、sox9和hnf6中的兩種的表達，例如ptf1a、sox9和hnf6中的全部三種的表達。在另一個實施方案中，步驟a+1)中的所述胰腺祖細胞的細胞群體特征進一步在于標志物ptf1a和sox9之一或兩者的表達。

132、在如本文所披露的方法的實施方案中，步驟b+1)中的細胞群體培養大約3至5天，例如大約3至4天或大約4至5天，例如大約4天。在一個實施方案中，步驟b+1)中的細胞群體培養大約5天。該培養時間被認為足以產生步驟c+1)的內分泌祖細胞的群體。

133、與步驟a)-c)中的描述類似，步驟a+1)–c+1)在2d基底上以2d培養進行。應當理解，與步驟a)–c)有關的2d基底的討論與步驟a+1)–c+1)同等相關，并且僅僅為了簡潔起見此處不再重復。

134、因此，在如本文所披露的一個實施方案方法中，步驟b+1)中的細胞在2d基底上培養。在一個實施方案中，所述細胞粘附于所述2d基底。所述2d基底可包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白及其片段、明膠及其片段、官能化絲(fn絲)、以及基質膠tm，例如選自由以下組成的組：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白及其片段、明膠及其片段、以及基質膠tm，例如選自由以下組成的組：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白、明膠、以及基質膠tm，例如選自由以下組成的組：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、以及基質膠tm。

135、在一個實施方案中，所述2d基底可包含以下或由以下組成：層粘連蛋白(ln)及其片段，例如重組產生的層粘連蛋白(ln)及其片段。

136、在如本文所披露的方法的一個實施方案中，其中所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、ln-121及其片段、以及ln-111及其片段；

137、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、以及ln-121及其片段；

138、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、以及ln-332及其片段；

139、例如由ln-521及其片段組成的組或由ln-511及其片段組成的組。在一個實施方案中，所述層粘連蛋白及其片段選自由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421、ln-121和ln-111；例如由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421和ln-121，例如由以下組成的組：ln-521、ln-511和ln-332；例如由以下組成的組：ln-521和ln-511；例如其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-521或其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-511。

140、在一個實施方案中，所述一個或多個其片段是e8片段。在一個實施方案中，所述層粘連蛋白和片段包含層粘連蛋白的e8片段，例如選自由以下組成的組的e8片段：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、ln-421的e8片段、ln-121的e8片段和ln-111的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、以及ln-421的e8片段和ln-121的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段和ln-332的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段和ln-521的e8片段；例如ln-511的e8片段或ln-521的e8片段。

141、如上所討論，“允許分化的條件”是指允許細胞表現出所述細胞類型的特征的條件，并且可以包括細胞培養基的組合、外在因子的存在和/或不存在及其時間設置。所述因子以及它們的衍生物和激動劑已經關于上面的步驟b)和b-1)詳細討論，并且僅為了簡潔起見此處將不再重復所述討論。

142、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基是適合在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養胰腺祖細胞的培養基。階段5(s5)培養基的非限制性實例如本實施例中所定義。技術人員理解可以使用其他合適的培養基。步驟b+1)中的所述培養基可以補充本文指定的其他因子。

143、因此，在一個實施方案中，提供了一種方法，其中步驟b+1)包括在包含一種或多種選自以下的因子的培養基中培養所述細胞群體：btc及其衍生物和激動劑、視黃酸及其衍生物和激動劑、alk5抑制劑(例如alk5i?ii)及其衍生物和激動劑、視黃酸及其衍生物和激動劑、γ-分泌酶抑制劑(例如gsi-xx)及其衍生物和激動劑、gc-1及其衍生物和激動劑、ldn及其衍生物和激動劑、視黃酸及其衍生物和激動劑、以及sant-1及其衍生物和激動劑；例如一種或多種選自以下的因子：btc、alk5抑制劑(例如alk5i?ii)、γ-分泌酶抑制劑(例如gsi-xx)、gc-1、ldn、視黃酸和sant-1。因此，在一個實施方案中，提供了一種方法，其中步驟b+1)包括在包含以下的培養基中培養所述細胞群體：btc或其衍生物或激動劑；alk5抑制劑(例如alk5i?ii)或其衍生物或激動劑；γ-分泌酶抑制劑(例如gsi-xx)或其衍生物或激動劑；gc-1或其衍生物或激動劑、ldn或其衍生物或激動劑；視黃酸或其衍生物或激動劑；以及sant-1或其衍生物或激動劑；例如btc、alk5抑制劑(例如alk5i?ii)、γ-分泌酶抑制劑(例如gsi-xx)gc-1、ldn、視黃酸和sant-1。因此，在一個實施方案中，提供了一種方法，其中步驟b+1)包括在包含以下的培養基中培養所述細胞群體：btc和/或其衍生物和/或激動劑；alk5抑制劑(例如alk5i?ii)和/或其衍生物和/或激動劑；γ-分泌酶抑制劑(例如gsi-xx)和/或其衍生物和/或激動劑；gc-1和/或其衍生物和/或激動劑；ldn和/或其衍生物和/或激動劑；視黃酸和/或其衍生物和/或激動劑；以及sant-1和/或其衍生物和/或激動劑。應當理解，培養基可以包含因子及其衍生物和/或激動劑的混合物。在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟b+1)包括在包含btc、alk5i?ii、gsi-xx、gc-1、ldn、視黃酸和sant-1的培養基中培養所述細胞群體。特定地，在一個實施方案中，提供了一種方法，其中步驟b+1)包括在包含至少alk5抑制劑或其衍生物或激動劑和γ-分泌酶抑制劑及其衍生物和激動劑(例如alk5i?ii和gsi-xx)的培養基中培養所述細胞群體。

144、btc，也稱為乙胞素，是egf生長因子家族的成員，并誘導β細胞的分化，也可誘導其他細胞類型的分化。如本文所用，術語“btc及其衍生物和激動劑”是指egfr配體/egf家族生長因子。

145、alk5抑制劑的實例是alk5i?ii(alk5抑制劑ii)，其是tgf-β1型激活素樣激酶受體alk5的細胞滲透性選擇性抑制劑。alk5抑制劑的非限制性實例包括alk5i?ii、ly2157299、ly364947、repsox、sb525334、a83-01、gw788388、ly-2109761、sb-505124和d4476。在一個實施方案中，所述alk5抑制劑或其衍生物或激動劑選自由以下組成的組：alk5i?ii、ly2157299、ly364947、repsox、sb525334、a83-01、gw788388、ly-2109761、sb-505124和d4476。

146、gsi-xx，也稱為γ-分泌酶抑制劑xx，是可滲透細胞的二苯并氮雜卓化合物，該化合物抑制γ-分泌酶。γ-分泌酶是多亞基蛋白酶復合物(其本身是整合膜蛋白)，該復合物可在跨膜結構域內的殘基處切割單次跨膜蛋白。γ-分泌酶抑制劑的非限制性示例包括gsi-xx、dapt、ro4929097、yo-01027、bms-906024、aβ42-in-2、ly-411575和mk-0752。因此，在一個實施方案中，所述γ-分泌酶抑制劑選自gsi-xx、dapt、ro4929097、yo-01027、bms-906024、aβ42-in-2、ly-411575和mk-0752。

147、gc-1是甲狀腺激素受體(tr)激動劑并且比甲狀腺激素t3更有效。甲狀腺激素t3對于β細胞的發育很重要。

148、如本文所用，術語“gc-1及其衍生物和激動劑”是指gc-1、t3和t4。因此，在一個實施方案中，所述gc-1及其衍生物和激動劑選自由以下組成的組：gc-1、t3和t4。在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約10ng/ml至30ng/ml的btc，例如大約20ng/ml的btc。

149、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約5μm至15μm的alk5i?ii，例如大約10μm的alk5i?ii。

150、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約50nm至150nm的gsi-xx，例如大約100nm的gsi-xx。

151、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約0.5μm至1.5μm的gc-1，例如大約1μm的gc-1。

152、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約50nm-150nm的ldn，例如75nm-125nm的ldn，例如大約100nm的ldn。

153、在一個實施方案中，步驟b+1)中的所述培養基包含大約25nm至150nm的ra，例如大約100nm的ra。

154、在一個實施方案中，步驟b-1)中的所述培養基包含大約0.10μm至0.50μm的sant-1，例如大約0.25μm的sant-1。

155、在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟b+1)包括在包含大約20ng/ml的btc、大約10μm的alk5i?ii、大約100nm的gsi-xx、大約1μm的gc-1、大約100nm的ldn、大約100nm的ra和大約0.25μm的sant-1的培養基中培養細胞群體。

156、如上所解釋，本披露基于令人驚訝的認識，即在允許分化為胰腺祖(pp)細胞的條件下，后前腸(pf)細胞的短培養時間會產生更多數量的內分泌祖(ep)細胞，即使獲得的pp細胞數量低于在培養時間較長的相應方法中的數量。

157、在如本文所披露的一個實施方案中，提供了一種方法，其中在步驟c+1)中，總細胞群體的超過大約30％，例如超過大約40％、40％，例如超過大約45％，例如超過大約50％是內分泌祖細胞，例如以表達nkx6.1和至少neurod1為特征的內分泌祖細胞。如上文所討論和舉例說明，標志物pdx1、nkx6.1、neurod1和ngn3中的兩種或更多種的其他組合可以用作內分泌祖細胞的特征

158、在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，其中步驟c+1)中的內分泌祖細胞的數量與使用相應方法獲得的內分泌細胞的數量相比更高，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約24小時或更短和/或大約96小時或更長。如所附實例中所示，與步驟b)中培養時間更長或更短的方法相比，通過如本文所披露的方法獲得的ep細胞的數量顯著更高。特定地，這是令人驚訝和出乎意料的，因為與當步驟b)為大約24小時或更短和/或為大約96小時或更長時的pp細胞數量相比，pp細胞的數量更少。這種效應在所附實施例且特別是圖4中得到證明，其中通過nkx6.1和neurod1的共表達對內分泌祖細胞的數量進行評分。重要的是，這種效應在不同人干細胞系(包括人es細胞系和ips細胞系)的細胞培養物中得到了體現。

159、在一個實施方案中，所述方法產生比相應方法多至少大約10％，例如至少大約15％，例如至少大約20％，例如至少大約30％，例如至少大約40％，例如至少50％，例如至少60％的內分泌祖細胞，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約24小時或更短和/或大約96小時或更長。

160、應理解，在步驟c+1)中獲得的內分泌祖細胞可進一步分化為胰腺單激素β細胞。因此，在如本文所述的方法的一個實施方案中，該方法還包括在允許分化為胰腺β細胞(例如單激素胰腺β細胞)的條件下培養所述內分泌祖細胞。

161、在所述方法的一個實施方案中，在表現出內分泌祖細胞的特征性標志物的表達之前，不將細胞從2d基底上的培養轉移至3d基底上的培養。內分泌祖細胞以表達pdx1、nkx6.1、以及neurod1和ngn3中的至少一種為特征，如上所討論。

162、在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露的方法，所述方法在步驟a+1)–c+1)之后，還包括以下的步驟a+2)–c+2)：

163、a+2)將所述內分泌祖細胞的群體，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞的群體，從2d基底上的培養轉移至3d培養條件；

164、b+2)在允許分化為胰腺單激素β細胞的條件下培養所述內分泌祖細胞的群體；以及

165、c+2)從而生成胰腺單激素β細胞的群體，這些胰腺單激素β細胞是例如以表達胰島素為特征的胰腺單激素β細胞。所述單激素β細胞還可以表達nkx6.1、pdx1和neurod1中的至少一種。

166、在一個實施方案中，步驟c+2)中生成的所述胰腺單激素β細胞的群體是至少一個胰島樣細胞聚集體的一部分。

167、在一個實施方案中，將所述內分泌祖細胞的群體從2d基底上的培養轉移至3d培養條件的步驟a+2)包括i)提供所述ep細胞的群體的單細胞懸浮液；以及ii)允許單細胞懸浮液中的所述ep細胞的群體形成3d結構。在一個實施方案中，所述步驟a+2是在允許分化為胰腺單激素β細胞的條件下進行的，例如在允許分化為胰腺單激素β細胞的細胞培養基中。在一個實施方案中，提供所述ep細胞的群體的單細胞懸浮液的所述步驟i)在將所述細胞從允許分化為內分泌祖細胞的條件轉移至允許分化為胰腺單激素β細胞的條件(例如從允許分化為內分泌祖細胞的細胞培養轉移至允許分化為胰腺單激素β細胞的細胞培養基)之后24、48、72或96天進行。

168、在ii)中，允許單細胞懸浮液中的ep細胞形成3d結構。在一個實施方案中，3d培養條件允許細胞自我聚集。所述聚集可以是強制或誘導聚集，但也可以是自發聚集。所述聚集導致如本文所披露的胰島樣細胞聚集體的形成。

169、在一個實施方案中，步驟ii)在rock抑制劑存在下進行。所述rock抑制劑可以是h1152或其任何類似物或激動劑。在一個實施方案中，h1152的濃度范圍為>0μm至10μm。如本發明實施例中所示，并且在不受理論束縛的情況下，發明人認為h1152可以促進s5?ep細胞作為單細胞在懸浮液中的存活。因此，在如本文所披露的方法的一個實施方案中，所述rock抑制劑在階段ii)期間的大約24小時期間存在于培養基中。

170、技術人員應當理解，提供ep細胞的群體的單細胞懸浮液的步驟i)涉及將ep細胞從2d基底上的貼壁培養物解離成單細胞。此類解離可能涉及使用解離試劑，例如天然存在的酶、更溫和的非酶替代品，或者可以通過螯合鈣來進行以防止鈣粘蛋白附著，使細胞從表面和彼此釋放。解離可以通過機械手段進行。解離試劑的非限制性實例包括胰蛋白酶、膠原酶、替換酶(displases)以及解離試劑例如accumaxtm和acs-3010。在一個實施方案中，提供ep細胞的群體的單細胞懸浮液的步驟i)涉及通過酶促手段解離ep細胞，例如使用包含酶(例如蛋白水解酶和/或溶膠原酶)的溶液。例如，這樣的溶液可以是技術人員知道用于解離ep細胞和提供ep細胞的群體的單細胞懸浮液的適當方法。

171、在一個實施方案中，所述解離是在使細胞經歷允許分化為胰腺單激素β細胞的條件之前進行，例如在允許分化為胰腺單激素β細胞的培養基中培養細胞之前進行。在一個實施方案中，所述解離在從允許分化為內分泌祖細胞的條件改變為允許分化為胰腺單激素β細胞的條件后，例如在將培養基從允許分化為內分泌祖細胞的培養基改變為允許分化為胰腺單激素β細胞的培養基后至多96小時，例如至多72小時，例如至多48小時，例如至多24小時進行。例如，如所附實施例中所述，從s5培養基改變為s6培養基后至多96小時，例如至多72小時，例如至多48小時，例如至多24小時。在一個實施方案中，所述解離在從允許分化為內分泌祖細胞的條件改變為允許分化為胰腺單激素β細胞的條件后24-48小時進行。

172、在步驟ii)中，允許單細胞懸浮液中的ep細胞形成3d結構。在一個實施方案中，3d培養條件允許細胞自我聚集。所述聚集可以是強制或誘導聚集，但也可以是自發聚集。

173、在一個實施方案中，步驟b+2)中的所述培養基是適合在允許分化為單激素β細胞的條件下培養內分泌祖細胞的培養基。這樣的階段6(s6)培養基的非限制性實例如本實施例中所定義。技術人員理解可以使用其他合適的培養基。步驟iv)中的所述培養基可以補充本文指定的其他因子。

174、trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-甲酸)是維生素e的水溶性類似物，具有強大的抗氧化作用。trolox也是強大的膜損傷抑制劑。在一個實施方案中，步驟iv)中的所述培養基包含大約5μm至15μm的trolox，例如約10μm的trolox。如技術人員理解的，可以用其衍生物或激動劑代替trolox。

175、n-乙?；?l-半胱氨酸是細胞培養組分，例如用于培養小鼠腸道干細胞的腸道基礎培養基，并且也可作為擴增培養基的組分。在一個實施方案中，步驟iv)中的所述培養基包含大約0.5mm至3mm的n-乙?；?l-半胱氨酸，例如約1mm的n-乙?；?l-半胱氨酸。如技術人員理解的，可以用其衍生物或激動劑代替n-乙?；?l-半胱氨酸。

176、h1152是rho激酶抑制劑并且是細胞滲透性、高特異性、可逆、有效并且atp競爭性的rho相關激酶(rock)抑制劑。如技術人員理解的，可以用其衍生物或激動劑代替h1152。

177、gc-1是甲狀腺激素受體(tr)激動劑并且比甲狀腺激素t3更有效。甲狀腺激素t3對于β細胞的發育很重要并且下面將更詳細地討論。在一個實施方案中，步驟iv)中的所述培養基包含大約0.5μm至3μm的gc-1，例如約1μm的gc-1。如技術人員理解的，可以用其衍生物或激動劑代替gc-1。

178、在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟b+2)包括在包含h1152、gc-1、trolox和n-乙酰基-l-半胱氨酸的培養基中培養ep細胞群體。在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟iv)包括在包含h1152、gc-1、trolox和n-乙酰基-l-半胱氨酸的培養基中培養ep細胞群體大約3周，隨后在包含大約gc-1、trolox、n-乙?；?l-半胱氨酸但不包含h1152的培養基中培養。

179、在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟b+2)包括在包含大約10μmh1152、大約1μm?gc-1、大約10μm?trolox和大約1mm?n-乙酰基-l-半胱氨酸的培養基中培養ep細胞群體。在一個實施方案中，如本文所披露的方法的步驟iv)包括在包含大約10μmh1152、大約1μm?gc-1、大約10μm?trolox和大約1mm?n-乙?；?l-半胱氨酸的培養基中培養ep細胞群體大約3周，隨后在包含大約1μm?gc-1、大約10μm?trolox和大約1mm?n-乙酰基-l-半胱氨酸但不包含h1152的培養基中培養。

180、在一個實施方案中，步驟b+2)中的所述培養物在搖床上，例如定軌搖床上。

181、在一個實施方案中，所述3d培養條件允許細胞自我聚集。不受理論的束縛，設想自我聚集允許選擇性富集內分泌祖細胞。另外，設想所述選擇性富集導致所述培養物中胰腺單激素β細胞的生成增加。在一個實施方案中，所述胰腺單激素β細胞作為細胞聚集體的一部分生成。在一個實施方案中，所述聚集體包含單激素β細胞。在一個實施方案中，所述聚集進一步包含胰腺單激素α細胞(α細胞)和/或δ細胞。

182、在一個實施方案中，步驟a+2)中的所述內分泌祖細胞的群體以以下為特征：表達nkx6.1、pdx1和neurod1；或表達nkx6.1、pdx1和ngn3；或表達pdx1、nkx6.1、neurod1和ngn3。

183、在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達胰島素和pdx1為特征。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達胰島素和nkx6.1為特征。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達胰島素和neurod1為特征。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達以下為特征：胰島素以及nkx6.1、pdx1和neurod1中的兩種；例如胰島素、nkx6.1和pdx1；或胰島素、nkx6.1和neurod1；或胰島素、pdx1和neurod1。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達以下為特征：胰島素以及pdx1、nkx.1和neurod1。

184、在一個實施方案中，步驟a+2)–c+2)在步驟a+1)–c+1)之后，例如緊接步驟a+1)–c+1)之后。應當理解，在進行步驟a+2)–c+2)之前，可以將內分泌祖細胞冷凍保存期望的時間段。在這種情況下，步驟a+2)–c+2)在冷凍保存步驟以及隨后復蘇冷凍保存的細胞之后。因此，步驟a+1)–c+1)隨后很可能是冷凍保存，例如冷凍保存步驟以及隨后復蘇冷凍保存的細胞；冷凍保存隨后是步驟a+2)–c+2)。技術人員熟悉冷凍保存的細胞的復蘇過程，一般而言，其包括在37℃水浴中快速解凍細胞，通過溫和離心和/或用生長培養基稀釋從冷凍培養基中去除細胞，以及將細胞接種在培養容器中的完全生長培養基中。因此，在一個實施方案中，步驟a+2)–c+2)在c+1)中獲得的ep細胞的冷凍保存和隨后的復蘇之后。如所附實施例中所示，冷凍保存不會對所述胰島樣細胞聚集體或單激素β細胞的生成產生負面影響。

185、在一個實施方案中，步驟b+2)包括將所述內分泌祖細胞的群體培養大約3周或更長，例如大約3至5周，例如大約4周。

186、如本文所用，術語“單激素”是指僅表達一種激素的細胞。例如，單激素β細胞僅表達胰島素，且不表達由胰島細胞表達的其他激素，例如胰高血糖素或生長抑素。如本文所用，術語“多激素”是指表達至少兩種不同激素的細胞。

187、體內單激素β細胞是單激素細胞，并且有利的是，通過本發明方法獲得的群體表現出體內天然β細胞或體內內源性β細胞的特性，例如體內健康天然β細胞或體內健康內源性β細胞的特性。

188、因此，在如本文所披露的本方法的一個實施方案中，步驟c+2)中生成的所述β細胞的群體是單激素的。特定地，步驟c+2)中生成的所述單激素β細胞的群體不表達胰高血糖素或生長抑素。特定地，步驟c+2)中生成的所述單激素β細胞的群體不表達胰高血糖素和生長抑素。

189、應當理解，與其中步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約96小時或更長的現有技術的方法相比，通過本方法獲得的ep細胞的增加的比例和/或數量可以轉化為更高比例的如本文所定義的單激素β細胞，例如胰島樣細胞聚集體中的更高比例的單激素β細胞。

190、如此，在如本文所披露的方法的一個實施方案中，提供了一種方法，其中在步驟c+2)中，總細胞群體的超過大約40％，例如大約40％至50％，例如大約40％至60％，例如大約40％至70％是單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述方法產生比相應方法多至少30％，例如至少大約35％，例如至少大約40％的單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約96小時。所述單激素β細胞的特征可以在于胰島素以及nkx6.1、pdx1和neurod1中的至少一種，例如胰島素和nkx6.1的表達。

191、在一個實施方案中，所述單激素β細胞的總細胞群體表達胰島素，并特征可以進一步在于nkx6.1、pdx1和/或neurod1的表達。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的總細胞群體以表達以下為特征：胰島素和nkx6.1；胰島素和pdx1；或胰島素和neurod1。

192、在一個實施方案中，所述單激素β細胞的總群體以表達以下為特征：胰島素、以及nkx6.1、pdx1和neurod1中的兩種；例如胰島素、nkx6.1和pdx1；或胰島素、nkx6.1和neurod1；或胰島素、pdx1和neurod1。在一個實施方案中，所述單激素β細胞的群體以表達以下為特征：胰島素以及pdx1、nkx6.1和neurod1。

193、在一個特定實施方案中，所述方法產生比以表達胰高血糖素為特征的單激素胰腺α細胞多至少2倍的胰腺單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的胰腺單激素β細胞。

194、技術人員理解，單激素胰腺β細胞不僅表達胰島素以及成熟胰腺β細胞的特征性標志物，而且所述單激素β細胞是功能性胰腺β細胞并因此能夠應答于葡萄糖刺激。葡萄糖刺激的結果可以通過胰島素產生和/或通過c肽的表達來評分。c肽與胰島素同時釋放，并且對于每個產生的胰島素分子，就有一個由β細胞產生的c肽分子。c肽本身并不影響血糖，但c肽是胰島素產生的有用標志物，因為c肽在血液中的停留時間往往比胰島素長。

195、如上所解釋，步驟c+2)中獲得的胰腺單激素β細胞的群體可能是至少一個胰島樣細胞聚集體的一部分。

196、因此，在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含至少大約25％，例如至少大約30％，例如至少大約35％，例如至少大約40％，例如至少大約45％，例如至少大約50％，例如至少大約55％，例如至少大約60％，例如至少大約65％，例如至少大約70％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含大約25％至70％，例如30％至70％，例如30％至70％的單激素β細胞，例如35％至70％，35％至70％，例如40％至70％，例如45％至70％，例如45％至65％，例如45％至60％，例如45％至55％，例如大約50％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含大約35％至65％，例如40％至65％，例如40％至60％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含大約7％至25％，例如7％至20％、10％至20％，例如15％至20％，例如大約20％的單激素α細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含至多大約10％，例如至多大約7％，例如至多大約6％，例如至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約0.5％，例如至多大約0.3％，例如至多大約0.1％的多聚激素α細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含至多大約10％，例如至多大約7％，例如至多大約6％，例如至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約0.5％，例如至多大約0.3％，例如至多大約0.1％的多激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含少于5％，例如少于4％，例如少于3％，例如少于1％的δ細胞。

197、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體包含至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約1％，例如至多大約0.5％，例如至多大約0.1％的增殖細胞，例如表達ki-67的增殖細胞。

198、在一個實施例中，所述胰島樣細胞聚集體包含至少40％，例如至少50％的單激素β細胞；大約15％至20％、例如大約20％的單激素α細胞，和少于大約2％、例如少于大約1％的增殖細胞。

199、在一個實施方案中，在培養的第38-42天或之后研究評分胰島樣細胞聚集體的組成。例如在第38、39、40、41或42天。換言之，在階段6結束時研究胰腺胰島樣細胞聚集體的組成。

200、因此，在一個實施方案中，提供了如本文所述的方法，

201、其中所述單激素β細胞是功能性胰腺β細胞，例如通過葡萄糖刺激后c肽的表達來評分的功能性胰腺β細胞。

202、本方法的目的是通過體外分化的方式提供胰腺β細胞譜系的哺乳動物細胞，例如胰腺β細胞譜系的人細胞。來源細胞可以是多能細胞，例如多能細胞的細胞系，例如胚胎干細胞或誘導性多能干細胞。因此，細胞可以來自已建立的細胞系，或者可替代地，所述細胞可以是直接衍生自患者的原代細胞，例如患者特異性細胞。因此，在如本文所披露的方法的一個實施方案中，步驟a)或a-1)中的細胞群體衍生自多能干細胞的培養物，例如誘導性多能干細胞(ips)的培養物或胚胎干細胞(es)的培養物。在一個實施方案中，步驟a)或a-1)中的細胞群體是直接衍生自患者的原代細胞群體。可替代地，步驟a)或a-1)中的細胞群體可以衍生自專能細胞的培養物，例如已被限制為內胚層譜系的細胞系。所述細胞可以是人細胞。

203、在一個實施方案中，步驟a)或a-1)中的所述細胞群體是哺乳動物細胞群體，例如人細胞群體。

204、本領域已知干細胞是根據其在單細胞水平上自我更新和分化的能力來定義的未分化細胞。干細胞可產生子代細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和終末分化細胞。干細胞的特征還在于它們能夠在體外分化為來自多個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的各種細胞譜系的功能細胞。干細胞在移植后還會產生多個胚層的組織，并在注射到囊胚后對大多數(如果不是全部)組織產生大量貢獻。

205、干細胞根據其發育潛力分為：(1)全能，意味著能夠產生所有胚胎和胚胎外細胞類型；(2)多能，意味著能夠產生所有胚胎細胞類型；(3)專能，意味著能夠產生細胞譜系的子集，但全部在特定的組織、器官或生理系統內；(4)寡能，意味著能夠產生比專能干細胞更受限制的細胞譜系子集；以及(5)單能，意味著能夠產生單一細胞譜系。

206、如上所解釋，分化是非特化(“未定向”)或特化程度較低的細胞獲得特化細胞(諸如，例如神經細胞或肌肉細胞)的特征的過程。分化的細胞或分化誘導的細胞是在所述細胞的譜系中占據更特化(“定向”)位置的細胞。術語“定向”在應用于分化過程時是指細胞在分化途徑中已經進行到在正常情況下會繼續分化為特定細胞類型或細胞類型子集，并且在正常情況下不能分化為不同的細胞類型或恢復到分化程度較低的細胞類型?！叭シ只笔侵讣毎謴偷郊毎V系內不太特化(或定向)的位置的過程。

207、值得注意的是，本發明的技術傳授可以使用任何人多能胚胎干細胞付諸實踐，包括在不破壞人胚胎的情況下衍生的人多能胚胎干細胞，例如來自孤雌生殖激活的卵母細胞。在特定實施方案中，步驟a)或步驟a-1)中的所述細胞群體衍生自人胚胎干細胞群體。在一個實施方案中，步驟a)或步驟a-1)中的所述細胞群體衍生自人胚胎干細胞群體，其是在不破壞人胚胎的情況下獲得的。

208、在一個特定實施方案中，步驟a)或步驟a-1)中的所述細胞群體衍生自人胚胎干細胞群體，例如選自以下的人胚胎干細胞群體：由hs980細胞、h1細胞和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組，例如由h1細胞和hs980細胞組成的胚胎干細胞系的組，或由h1和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組，或由hs980細胞和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組。在一個實施方案中，所述細胞是h1細胞。在一個實施方案中，所述細胞是h9細胞。在一個實施方案中，所述細胞是hs980細胞。在一個實施方案中，所述人胚胎干細胞群體是在不破壞胚胎的情況下獲得的群體。

209、僅出于遵守歐洲專利實踐的目的，上述與hs980、h1和/或h9細胞相關的實施方案將被視為歐洲司法管轄區的參考實例。在一個特定實施方案中，步驟a)、a-1)、a+1)或i)中的所述細胞群體衍生自ips細胞，例如人ips細胞。

210、在一個特定實施方案中，所述ips細胞選自由患者衍生的ips細胞和ips細胞系組成的組。在一個特定實施方案中，所述例如ips細胞系是ctrl-7-ii(c7)。c7在kele?m等人2016中進行了描述。

211、技術人員應當理解，術語胰腺β細胞譜系可以指胰腺祖細胞或內分泌祖細胞或胰腺β細胞。換言之，本文所披露的方法可以用于生成胰腺祖細胞或內分泌祖細胞或胰腺β細胞。

212、因此，在一個實施方案中，提供了一種如本文所述的方法，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是胰腺祖細胞。在一個實施方案中，提供了一種如本文所述的方法，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是內分泌祖細胞。在一個實施方案中，所述胰腺β細胞譜系細胞是胰腺β細胞。

213、如上所討論，所述方法還可以包括細胞冷凍保存的步驟，特別是其可能適合于冷凍保存內分泌祖細胞。因此，在一個實施方案中，提供了一種包括冷凍保存內分泌祖細胞的步驟的方法。在一個實施方案中，所述內分泌祖細胞的冷凍保存是步驟c+1)中生成的細胞的冷凍保存。

214、在本披露的第二方面，提供了可通過前述項目中任一項所述的方法獲得的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體。應當理解，所述分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體可用于療法(例如細胞替代療法)，以及用于藥物開發或其他研究應用。特定地，應當理解，在不需要任何另外的細胞選擇或分選的情況下，提供表現出高百分比或高分數的期望細胞類型的群體是有利的。為了澄清，與胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體相關的術語“分離的”是指將細胞從其自然環境(例如體內環境)中去除(換言之，分離)。應當理解，如本文所披露的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體可以是細胞聚集體的一部分或構成在細胞培養期間形成的整個細胞聚集體，例如如本文所披露的分離的胰島樣細胞聚集體。除了所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體之外，所述分離的胰島樣細胞聚集體還可包含例如胰腺α和/或δ細胞或一個或多個胰腺α和/或δ細胞譜系的細胞。本披露的分離的胰島樣細胞聚集體含有如上文所披露的細胞類型。

215、因此，在分離的胰腺β細胞群體或分離的胰腺β細胞譜系細胞或分離的胰島樣細胞聚集體的一個實施方案中，提供了尚未經受針對所期望表型富集的細胞群體，例如尚未經受針對所期望表型的分選，例如基于所期望標志物表達的分選或例如基于facs的針對所期望表型的分選。為了清楚起見，如本文所用，術語“富集”是指通過干預(例如手動或經由機器的方式干預，例如自動干預或分選，例如根據細胞的特性對細胞進行分選)來富集細胞，而不是指細胞培養中自然發生的過程。在一個實施方案中，所述細胞在步驟a+2)中形成3d結構之前沒有經受所述富集。

216、本發明群體的特征在于通過本身的分化方法獲得的具有所期望特性的細胞的高百分比。因此，在本方面的一個實施方案中，提供了分離的胰腺β細胞的群體，其中總細胞群體的超過大約40％，例如大約40至60％，例如大約40至50％是單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述群體包含比以表達胰高血糖素為特征的單激素胰腺α細胞多至少2倍的以表達胰島素為特征的單激素胰腺β細胞。

217、所述單激素β細胞可以如上所述來表征，例如通過表達胰島素和標志物nkx6.1、pdx1和neurod1中的至少一種或多種，例如兩種。所述單激素β細胞可以以表達胰島素和nkx6.1為特征，例如以表達胰島素、nkx6.1以及pdx1和neurod1中的至少一種為特征。在一個實施方案中，所述單激素β細胞可以以表達胰島素、nkx6.1、pdx1和neurod1為特征。

218、在一個實施方案中，所述單激素β細胞可以包含細胞聚集體的部分，例如還包含胰腺單激素α和/或δ細胞的分離的胰島樣細胞聚集體的部分。技術人員理解，預期分離的胰島樣細胞聚集體和由其衍生的分離的細胞群體表現出相似的細胞類型分布。

219、在一個實施方案中，所述分離的胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含至少大約25％，例如至少大約25％，例如至少大約30％，例如至少大約35％，例如至少大約40％，例如至少大約45％，例如至少大約50％，例如至少大約55％，例如至少大約60％，例如至少大約65％，例如至少大約70％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含大約25％至70％，例如約30％至70％，例如約40％至70％，例如約40％至60％的單激素β細胞。

220、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含至少40％，例如至少45％，例如至少50％，例如至少55％β細胞，例如至少60％的β細胞，例如至少65％，例如至少70％的β細胞單激素β細胞。在一個實施方案中，所述單激素β細胞以胰島素表達為特征。

221、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含至多大約20％，例如至多大約18％，例如至多大約16％，例如至多大約13％，例如至多大約10％的單激素α細胞。在一個實施方案中，所述單激素α細胞以表達胰高血糖素為特征。

222、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含單激素β細胞和α細胞，并且包含少于大約5％，例如少于大約4％、3％、2％或1％的選自由以下組成的組的細胞：δ細胞、腺泡細胞、導管細胞和活化的星狀細胞。在所述方法的一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含至多大約5％，例如至多大約4％、3％、2％或1％的多激素細胞。在所述方法的一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或衍生自其的分離的細胞群體包含至多大約5％，例如至多大約4％、3％、2％或1％的非內分泌細胞。

223、在一個實施方案中，所述體外胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體在s6結束時進行評分，例如在本文所述的培養的第38-42天，例如在第38、39、40、41、42天或更晚。

224、如上所解釋，步驟c+2)中獲得的胰腺單激素β細胞的群體可能是至少一個胰島樣細胞聚集體的一部分。

225、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含大約25％至70％，例如30％至70％，例如30％至70％的單激素β細胞，例如35％至70％，35％至70％，例如40％至70％，例如45％至70％，例如45％至65％，例如45％至60％，例如45％至55％，例如大約50％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含大約35％至65％，例如40％至65％，例如40％至60％的單激素β細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含大約7至25％，例如7至20％、10至20％，例如15至20％，例如大約20％的單激素α細胞。在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含至多大約10％，例如至多大約7％，例如至多大約6％，例如至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約0.5％、0.3％，例如至多大約0.1％的多激素α細胞。

226、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含至多大約10％，例如至多大約7％，例如至多大約6％，例如至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約0.5％，例如至多大約0.3％，例如至多大約0.1％的多激素β細胞。

227、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含少于5％，例如少于4％，例如少于3％，例如少于1％的δ細胞。

228、在一個實施方案中，所述胰島樣細胞聚集體或分離的從其衍生的細胞群體包含至多大約5％，例如至多大約4％，例如至多大約3％，例如至多大約2％，例如至多大約1％，例如至多大約0.5％，例如至多大約0.1％的增殖細胞，例如表達ki-67的增殖細胞。

229、在一個中，所述胰島樣細胞聚集體或由其衍生的分離的細胞群體包含至少40％，例如至少50％的單激素β細胞；大約15％至20％、例如大約20％的單激素α細胞，和少于大約2％、例如少于大約1％的增殖細胞。

230、在一個實施方案中，在培養的第38-42天或之后研究評分胰島樣細胞聚集體的組成。例如在第38、39、40、41或42天。換言之，在階段6結束時研究胰腺胰島樣細胞聚集體的組成

231、在本方面的一個實施方案中，提供了如本文所述的分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，其中所述群體是包含胰腺祖細胞的群體。在一個實施方案中，所述胰腺祖細胞的特征在于表達pdx1和nkx6.1，或者特征在于表達pdx1、nkx6.1和ptf1a，或者特征在于表達pdx1、nkx6.1和sox9，或者特征在于表達pdx1、nkx6.1、ptf1a和sox9。

232、在本方面的另一個實施方案中，提供了如本文所述的分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，其中所述群體是包含內分泌祖細胞的群體。所述內分泌祖細胞以表達nkx6.1和neurod1為特征，或者以表達pdx1、nkx6.1、ngn3和/或neurod1為特征。在一個實施方案中，其中總細胞的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％以表達nkx6.1和neurod1或ngn3為特征。所述內分泌祖細胞可以以表達以下為特征：nkx6.1和neurod1；nkx6.1和ngn3；或表達pdx1、nkx6.1、以及ngn3和neurod1中的至少一種；或以表達pdx1、nkx6.1、ngn3和neurod1為特征。

233、如上所提及，設想如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體將可用于治療和/或預防糖尿病。

234、因此，在本披露的第三方面，提供了如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在療法中使用(換言之，用作藥物)。應當理解，出于細胞替代療法的目的，所述細胞或胰島樣細胞聚集體可以被移植到有需要的患者體內。所述細胞替代療法可以是出于以下目的：向不具有內源性β細胞或僅具有無功能性β細胞的患者提供胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞，或者向需要更多胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的患者(因為他或她的內源性群體減少或功能低于健康患者狀態所需的)提供胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。所述細胞或胰島樣細胞聚集體可以衍生自供體，因此是同種異體的。例如，所述細胞可以衍生自親屬或無關供體或衍生自已建立的細胞系，例如具有沿著胰腺β細胞譜系發育的能力的干細胞系。非限制性實例包括hes細胞系、具有沿著內分泌譜系發育的潛力的非胚胎干細胞系(例如專能、寡能或單能細胞系)、ips細胞系和衍生自ips細胞的具有沿著胰腺β細胞譜系發育的能力的細胞系。所述細胞也可以是患者內源性的，例如衍生自從患者獲得的ips細胞或具有沿著胰腺β細胞譜系發育的能力的其他患者衍生的細胞。據認為，通過如本文所披露的方法獲得的群體或胰島樣細胞聚集體將有利于在療法中使用，因為所期望細胞類型的總細胞百分比高于通過先前描述的培養方法獲得的群體。因此，通過所披露的方法獲得的細胞群體或胰島樣聚集體將至少在較低程度上(如果即使有的話)需要經受細胞分選或類似的應激和潛在破壞性技術，以便獲得具有高百分比的所期望細胞類型的同質群體。因此，預計可以使用更健康和更有活力的細胞群體進行治療(例如移植)，這些細胞群體含有較低百分比的受損和/或不健康細胞，這被認為在較少潛在不良副作用和更好的臨床治療結果方面對患者有益。

235、在第四方面，提供了如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病(例如1型或2型糖尿病)中使用。在一個實施方案中，所述糖尿病是1型糖尿病。在一個實施方案中，所述2型糖尿病是胰島素缺乏型2型糖尿病。

236、在一個實施方案中，提供了分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞群體或分離的胰島樣細胞聚集體，用于在療法中的治療中使用，其中所述細胞群體或分離的胰島樣細胞聚集體已通過如本文所定義的方法生成。

237、在一個實施方案中，提供了分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞群體或分離的胰島樣細胞聚集體，用于在療法中使用(換言之，用作藥物)，其中所述使用包括以下步驟：根據如本文所定義的方法生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞或分離的胰島樣細胞聚集體；以及

238、向患者施用治療有效量的所述細胞或分離的胰島樣細胞聚集體。

239、在一個實施方案中，所述使用還包括從所述患者分離細胞(例如用于生成ips細胞的細胞)或從所述患者分離干細胞，并根據如本文所定義的方法使用所述細胞生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞或分離的胰島樣細胞聚集體。

240、在一個實施方案中，提供了分離的胰腺單激素β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病(例如1型或2型糖尿病)中使用，其中所述細胞群體或分離的胰島樣細胞聚集體已通過根據如本文所定義的方法生成。

241、在另一個實施方案中，提供了分離的胰腺單激素β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病(例如1型或2型糖尿病)中使用，其中使用包括以下步驟：根據如本文所定義的方法生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞或分離的胰島樣細胞聚集體；以及

242、向患者施用治療有效量的所述細胞或分離的胰島樣細胞聚集體。在一個實施方案中，所述胰腺β細胞可以以如上述所定義的細胞聚集體的形式施用。在一個實施方案中，所述使用還包括從所述患者分離細胞(例如用于生成ips細胞的細胞)或從所述患者分離干細胞，并根據如本文所定義的方法使用所述細胞生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞。與關于第三方面所討論的類似，其他細胞類型被認為在這方面是有用的，包括同種異體細胞和內源細胞。

243、應當理解，所述細胞替代療法可以涉及胰腺β細胞(例如單激素胰腺β細胞)的移植，其然后在患者體內產生胰島素并且具有對該患者體內葡萄糖刺激適當應答的能力。應當理解，所述細胞替代療法可以涉及胰島樣細胞聚集體(細胞聚集體)或從其獲得的細胞的移植。

244、還設想，沿著胰腺β細胞譜系的早期發育階段的細胞，例如pp細胞或ep細胞。設想這些細胞將在患者體內中沿著胰腺β細胞譜系路徑繼續分化，并產生單激素胰腺β細胞，這些細胞在體內具有功能，并在患者體內產生胰島素，并且具有對患者體內葡萄糖刺激適當應答的能力。

245、因此，在一個實施方案中，所述使用包括將所述細胞群體移植到有需要的患者體內。在一個實施方案中，所述使用包括將單激素胰腺β細胞移植到有需要的患者體內。在一個實施方案中，所述使用包括將內分泌祖細胞移植到有需要的患者體內。在另一個實施方案中，所述使用包括將胰腺祖細胞移植到有需要的患者體內。

246、設想所述分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體將可用作藥物組合物。

247、因此，在本披露的相關第五方面，提供了一種藥物組合物，其包含如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體和至少一種藥學上可接受的賦形劑或載劑。

248、還設想，將如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或如本文所披露的藥物組合物與促進所述細胞群體的生長、增殖和/或任選分化的負載基底一起施用可能是有益的。因此，在本披露的第六方面，提供了一種成套試劑盒，其包含如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或如本文所披露的藥物組合物和合適的負載基底。所述合適的負載基底可以是3d支架或2d支架，其包含合適的基底，例如與如本文所披露的第一方面結合討論的2d基底。為了簡潔起見，下面將僅簡要提及所述2d基底。因此，2d基底可以是以下中的任何一種或多種：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段；以及基質膠tm，例如ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段；ln-121及其片段、以及ln-111及其片段。例如，所述片段可以是e8片段。

249、在一個特定實施方案中，提供了一種成套試劑盒，其中負載基底是本文定義的2d基底，并且其中所述胰腺β細胞譜系細胞是內分泌祖細胞。在另一實施方案中，提供了一種成套試劑盒，其中負載基底是3d基底并且其中所述細胞是單激素β細胞。

250、應當理解，如本文所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體可以在生物學研究中具有許多用途，例如用于藥物篩選，例如體外藥物篩選。應當理解，通過如本文所披露的方法獲得的群體將是有益的，因為所期望的細胞類型的總細胞的百分比將高于通過先前描述的培養方法獲得的群體中的百分比。因此，本發明的細胞培養物將至少在較低程度上(如果即使有的話)需要經受細胞分選或類似的應激和潛在破壞性技術，以便獲得具有高百分比的所期望細胞類型的同質群體。具有高百分比的所期望細胞類型的同質群體可能會在藥物篩選測定中生成數據，這些數據較少地或不會受到來自其他不相關或污染細胞類型的一種或多種潛在應答的阻礙。因此，在本披露的第七方面，提供了如本文所披露的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體在藥物篩選(例如體外藥物篩選)中的用途。

251、在該上下文中，提供了一種用于體外藥物篩選的方法，該方法包括以下步驟：根據如本文所定義的方法生成胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞；以及將所述細胞暴露于至少一種候選藥物化合物。類似地，該方法可以包括生成分離的胰島樣細胞聚集體并將所述聚集體暴露于至少一種候選藥物化合物。所述方法可以還包括以下步驟：評價所述胰腺內分泌譜系細胞或所述聚集體對所述候選藥物化合物的應答。根據藥物篩選的目的，在該方法第一步驟中生成的細胞可能是胰腺祖細胞、內分泌祖細胞或單激素β細胞。另外，提供了一種用于體外藥物篩選的方法，該方法包括以下步驟：提供可通過本文的方法獲得的胰腺內分泌譜系細胞；以及將所述細胞暴露于至少一種候選藥物化合物。

252、在第八方面，提供了一種治療有需要的患者的方法，該方法包括向所述患者施用治療有效量的如本文所披露的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。此外，一種在有需要的患者中治療糖尿病的方法，該方法包括以下步驟：根據如本文所定義的方法生成胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞；以及

253、向所述患者施用治療有效量的所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。在一個實施方案中，所述細胞是同種異體的，而在另一個實施方案中，所述細胞是患者內源性的。

254、在一個實施方案中，所述方法用于治療糖尿病，例如1型或2型糖尿病。

255、因此，提供了一種在有需要的患者中治療糖尿病的方法，該方法包括向所述患者施用治療有效量的根據本文所披露的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞或分離的胰島樣細胞聚集體。此外，提供了一種治療有需要的患者的方法，該方法包括以下步驟：根據如本文所定義的方法生成胰腺內分泌譜系(例如胰腺β細胞譜系)細胞；以及

256、向所述患者施用治療有效量的所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。所述方法還可包括從所述患者分離細胞(例如用于生成ips細胞的細胞)或從所述患者分離干細胞，并根據如本文所定義的方法使用所述細胞生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞。如上所討論，所述胰腺β細胞譜系細胞可以是胰腺祖細胞、內分泌祖細胞或單激素β細胞。細胞還可以呈聚集體(例如本文披露的分離的胰島樣細胞聚集體)的形式。細胞可以通過移植施用。在一個實施方案中，所述細胞是患者內源性的，換言之，患者特異性細胞。在一個實施方案中，所述細胞是同種異體細胞。

257、在相關的第九方面，提供了如本文所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體用于制造藥物的用途，該藥物用于在有需要的患者中治療糖尿病。在一個實施方案中，其中所述藥物的所述制造包括通過如本文所定義的方法生成胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。應當理解，所述細胞可以是如本文所披露的胰腺祖細胞、內分泌祖細胞或單激素β細胞。細胞還可以呈聚集體(例如本文披露的分離的胰島樣細胞聚集體)的形式。在一個實施方案中，所述細胞是患者內源性的，換言之，患者特異性細胞。在一個實施方案中，所述細胞是同種異體細胞。

258、應當理解，與本披露及其實施方案的第三和第四方面相關的任何討論對于這八個方面以及相關的第九方面同樣相關，并且僅僅為了簡潔起見此處將不再重復。在一個實施方案中，提供了一種如本文所披露在有需要的患者中治療糖尿病的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿病。在一個實施方案中，所述施用包括將所述群體移植到所述患者體內。在一個實施方案中，所述施用包括將所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體或分離的胰島樣細胞聚集體移植到所述患者體內。

259、在仍另外相關的方面中，提供了用于生成胰腺祖細胞；用于生成內分泌祖細胞和用于生成單激素β細胞的方法，如下所討論。所述單激素β細胞可以是胰島樣細胞聚集體的一部分。技術人員應當理解，結合本披露的第一方面披露的任何實施方案與其中它們應用的這些另外的方面的方法同等相關。因此，指定例如步驟a)-c)的特征的任何實施方案與用于生成胰腺祖細胞；用于生成內分泌祖細胞和用于生成單激素β細胞的所述方法中的任一種相關；指定步驟a+1)–c+1)的特征的任何實施方案與用于生成內分泌祖細胞和用于生成單激素β細胞的所述方法中的任一種相關；以及指定步驟a+2)–c+2)的特征的實施方案與用于生成單激素β細胞的所述方法中的任一種相關。類似地，相同的邏輯適用于指定上文討論的步驟a-1)–c-1)的特征的任何實施方案。

260、在一個方面，提供了一種用于生成胰腺祖細胞的方法；其包括以下步驟

261、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

262、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；以及

263、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞。

264、在一個方面，提供了一種用于生成內分泌祖細胞的方法

265、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

266、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；

267、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞；

268、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體；

269、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

270、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

271、在另一方面，提供了一種用于生成單激素β細胞的方法，

272、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

273、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；

274、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞；

275、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體；

276、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

277、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞；

278、a+2)將所述內分泌祖細胞的群體從2d基底上的培養轉移至3d培養條件；

279、b+2)在允許分化為胰腺單激素β細胞的條件下培養所述內分泌祖細胞的群體；以及

280、c+2)從而生成單激素β細胞的群體，這些單激素β細胞是例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

281、在如本文所披露的所述用于生成胰腺祖細胞的方法、用于生成內分泌祖細胞的方法和用于生成單激素β細胞的方法的實施方案中，該方法在步驟a)–c)之前還包括以下的步驟a-1)–c-1)：

282、a-1)提供原始腸管細胞的細胞群體，這些原始腸管細胞是例如以表達hnf1β和hnf4α為特征的原始腸管細胞；

283、b-1)在允許分化為后前腸細胞的條件下培養所述原始腸管細胞的細胞群體不超過大約54小時；以及

284、c-1)從而生成后前腸細胞的群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞。

285、如本文所用，措辭“...的群體”在涉及某種類型細胞時意在解釋為包含所述細胞的群體。例如，措辭“ep細胞的群體”應理解為包含ep細胞的群體。該群體還可以另外包含其他細胞，例如但不限于早期發育階段的細胞，諸如例如pp細胞。

286、如本文所用，當術語“約”或“大約”關于數值使用時，應解釋為±10％，比如±9％、比如±8％、比如±7％、比如±6％，比如±5％、比如±4％、比如±3％、比如±2％、比如±1％的范圍。例如，當值敘述為約10時，這意指該值實際上在從9至11的范圍內，比如在從9.9至10.9的范圍內、比如在從9.8至10.8的范圍內、比如在從9.7至10.7的范圍內、比如在從9.6至10.6的范圍內、比如在從9.5至10.5的范圍內、比如在從9.4至10.4的范圍內、比如在從9.3至10.3的范圍內、比如在從9.2至10.2的范圍內、比如在從9.1至10.1的范圍內。

287、技術人員知道，與測量有關的數值受到測量誤差的影響，從而限制了其準確性。出于此原因，應用科學和技術文獻中的一般約定：數值的最后一位小數指示其準確度。在沒有給出其他誤差容限的情況下，通過將四舍五入約定應用于最后一位小數來確定最大容限，例如，對于3.5cm的測量值，誤差容限是3.45-3.54。當解釋專利說明書中的數值范圍時，技術人員在相同的基礎上進行。

288、雖然已經參考各種示例性方面和實施方案描述了本發明，但是本領域的技術人員應當理解，在不脫離本發明的范圍的情況下，可以進行各種改變并且可以用等同物來替換其要素。另外，在不脫離本發明的實質范圍的情況下，可以進行許多修改以使特定的情況、培養條件或細胞群體適應本發明的教導。因此，意圖是本發明不限于所設想的任何特定實施方案，而是本發明將包括落入所附權利要求的范圍內的所有實施方案。

289、圖1是沿著胰腺β細胞譜系的發育階段的示意圖，包括每個發育階段特征性標志物的表達。(a)胰腺內分泌細胞類型可以通過在皮氏培養皿中重現胚胎胰腺發育而從人多能胚胎干細胞(hes)或ips細胞生成。胰腺分化可被劃分為多個階段，包括定形內胚層(de)、原始腸管(pgt)、后前腸(pf)、多能胰腺祖細胞(pp)、內分泌祖細胞(ep)和胰島(isl)。每個階段表達的關鍵標志物如圖中所示。(b)圖1b是根據現有技術的長分化方案和如本文所披露的短分化方案的示意圖。分析了階段3和階段4(s3+s4)的長持續時間和短持續時間對隨后內分泌分化的影響。在階段2(s2)結束時、階段3(s3)結束時、階段4(s4)結束時、進入階段5(s5)四天時、以及階段6(s6)結束時檢查階段特異性標志物的表達。2d?ln-521是2d基底的實例并且可以被如本文所披露的其他2d基底替代。

290、圖2顯示了不同包被基底上胰腺分化的比較。使用長方案在基質膠、ln-511和ln-521包被板上分化hs980和h1細胞。在s4結束時或進入s5?4天時通過流式細胞術檢查關鍵祖細胞標志物pdx1、nkx6.1和neurod1的表達。顯示了(a)階段4和(b和c)階段5的hs980細胞的代表性點圖。顯示了代表hs980和h1細胞的結果的柱形圖。結果是根據三個獨立樣品計算的。為了在三種基底之間比較(a和b)pdx1+/nkx6.1+和(c)nkx6.1+/neurod1+細胞的百分比，在microsoft?excel中進行了不配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。

291、圖3顯示了原始腸管細胞(pgt)與后前腸細胞(pf)的不同培養長度的比較。hs980和h1細胞在ln-521包被的板上向s3分化。在s2結束時或進入s31天或2天時通過免疫細胞化學(icc)和流式細胞術分析pf標志物pdx1的表達。顯示了hs980細胞的代表性共焦顯微鏡圖片和點圖。(a)hs980細胞。(b)h1細胞。

292、圖4顯示了s4持續時間對內分泌分化的影響的評價結果。hs980、h1和h9細胞在ln-521包被的板上分化。s4的持續時間是1天、2天、3天、4天或5天。在s4結束時或進入s5四天時通過流式細胞術檢查祖細胞標志物nkx6.1和neurod1的表達。s6結束時檢查內分泌標志物胰島素(ins)和胰高血糖素(gcg)的表達。結果是根據多個獨立實驗計算的。為了比較不同s4持續時間中不同細胞群體的百分比，在microsoft?excel中進行了不配對的2尾t檢驗。(a)s4不同持續時間的示意圖。(b)s4和s5時hs980細胞中祖細胞標志物nkx6.1和neurod1表達分析的代表性點圖。(c)s5時h1和h9細胞中祖細胞標志物nkx6.1和neurod1表達分析的代表性點圖。(d)顯示nkx6.1+/neurod1+和nkx6.1+/neurod1-細胞的計算百分比的柱形圖。結果顯示h980、h1和h9細胞的百分比。(e)顯示s5時neurod1+和nkx6.1+細胞的計算百分比的柱形圖。結果顯示h980、h1和h9細胞的百分比。(f)s6時hs980、h1和h9細胞中ins和gcc表達分析的代表性點圖。(g)顯示總ins+/gcg-單激素β細胞和gcg+/ins-單激素α細胞的計算百分比的柱形圖。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。

293、圖5顯示了不同包被基底上胰腺分化的評估。使用短方案，在包被有不同重組人層粘連蛋白同種型(ln)或基質膠的板上hs980、h1和h9細胞朝向s5ep細胞分化。h1細胞還在包被纖連蛋白(fn)或玻連蛋白(vtn)的板上進行分化。進入s5四天時，通過流式細胞術測量nkx6.1和neurod1的表達。ln-332、ln-511、ln-521和基質膠上的hs980細胞在3d懸浮液中進一步朝向s6胰島細胞分化。在s6結束時通過流式細胞術測量ins和gcg的表達。s5?ep細胞的代表性點圖如圖5a-1和5a-2所示，s6胰島細胞的代表性點圖如圖5c所示。為了比較層粘連蛋白同種型和基質膠之間nkx6.1+/neurod1+細胞的百分比，在microsoft?excel中進行了配對2尾t檢驗。(b)nkx6.1+/neurod1+細胞的百分比。*p<0.05，**p<0.01。

294、圖6說明了s4和s5祖細胞培養物的3d懸浮液對胰島形成的影響。(a)示意圖顯示了使用短方案在ln-521上hs980細胞分化的時間線。細胞在s4結束時(上方時間線)或進入s54或6天時(下方時間線)解離成單細胞。每孔4x106個s4和s5細胞維持在3d懸浮液中，并進一步分化為s6胰島細胞用于分析。(b)在s6結束時，在顯微鏡下對胰島樣聚集體進行計數，然后解離成單個細胞進行細胞計數。通過流式細胞術測量ins和gcg的表達。顯示了代表性點圖。細胞群體的百分比和每孔的聚集體/細胞的數量顯示在柱形圖中，并且是根據三個獨立樣品計算的。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。

295、圖7顯示了懸浮液中聚集體形成過程中s5?ep細胞的富集。hs980和h1細胞在ln-521包衣的2d表面上朝向s5分化。進入s5?4天時，細胞被解離成單細胞，然后在懸浮液中維持一天以生成3d聚集體。通過流式細胞術檢查聚集體形成前后nkx6.1、neurod1和ki-67的表達。為了研究rock抑制劑h1152對聚集體形成的影響，將不同濃度的h1152(0至10μm)添加至單細胞懸浮液中，如圖所示。第二天，測量標志物的表達和胰島細胞數量。(a)、(b)和(c)中顯示了代表性點圖。nkx6.1+/neurod1+和neurod1+細胞的百分比是根據三個獨立實驗計算的，如(a)中的柱形圖所示。從3d懸浮液中的106個單細胞生成的胰島細胞數量根據三個獨立樣品進行計算，并且如(d)中的柱形圖所示。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。

296、圖8顯示了短胰腺分化方案和長胰腺分化方案的比較結果。使用如本文所披露的短方案和比較性長方案在ln-521包被的板上hs980和h1細胞分化為s5?ep細胞。進入s5四天時，細胞解離為單細胞，并在3d懸浮液中進一步成熟為胰島樣細胞聚集體。如圖所示(s3-s6)，在每個階段通過流式細胞術檢查關鍵標志物的表達。在s6結束時檢查體外葡萄糖刺激的胰島素c肽分泌。在顯微鏡下對胰島樣聚集體進行計數，然后解離成單細胞進行細胞計數。結果是根據多個獨立樣品計算的。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。(a)s3-5期間hs980細胞中nkx6.1和neurod1表達的代表性點圖。(b)顯示使用短方案和長方案獲得的nkx6.1+/neurod1+和nkx6.1+/neurod1-的定量的柱形圖。(c)使用短方案和長方案獲得的s6時hs980和h1細胞中ins和gcg表達的代表性點圖以及顯示其定量的柱形圖。(d)顯示使用短方案和長方案獲得的細胞中體外葡萄糖刺激的胰島素分泌的結果比較的柱形圖，以及顯示使用短方案和長方案的培養物中每孔的胰島樣聚集體和胰島細胞的數量的柱形圖。在s6時分析hs980細胞聚集體。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。

297、圖9顯示了細胞培養物中階段特異性標志物表達的免疫細胞化學分析。使用針對s4-s6期間表達的關鍵標志物的特異性抗體對使用短方案和長方案分化的hs980細胞進行分析。(a)s4細胞中pdx1、nkx6.1和neurod1的表達。(b)s5細胞中pdx1、nkx6.1和neurod1的表達。(c)s6細胞中胰島素c肽(cpep)、胰高血糖素(gcg)和生長抑素(sst)的表達。dapi染色用于可視化細胞。

298、圖10顯示了3d懸浮液中自發聚集與使用微孔板強制聚集之間的比較結果。h1細胞在ln-521包被的2d表面上朝向s5分化。進入s5四天時，細胞被解離成單細胞，然后維持在3d懸浮液(游離)、96孔板(96孔)或aggrewell板(aggrewell)中。在s5時聚集體形成前和聚集體形成后一天通過流式細胞術檢查nkx6.1、neurod1和ki-67的表達。代表性點圖如圖(a)中所示。s5nkx6.1+/neurod1+ep細胞和ki-67+增殖型細胞的百分比是根據多個獨立樣品計算的并且如(b)中的柱形圖所示。在懸浮液和aggrewell板中進行朝向s6胰島細胞的分化。在s6結束時通過流式細胞術檢查ins、gcg和ki-67的表達。代表性點圖如圖(c)中所示。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01。

299、圖11是本文披露的體外分化方案的示意圖。每個階段的因子和持續時間如所示。ln-521包被的表面上的細胞在第14天解離成單細胞，然后維持在3d懸浮液中。

300、圖12顯示了人esc和ipsc系中的胰腺分化。細胞使用短方案進行分化。進入s5四天時和s6結束時通過流式細胞術檢查關鍵標志物的表達。在s6結束時檢查體外葡萄糖刺激的胰島素c肽分泌。結果是根據多個獨立實驗計算的。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，*****p<0.00001。(a)和(b)中顯示了s6時ins和gcg表達以及s5時nkx6.1和neurod1表達的代表性點圖。(a)中顯示了顯示ins+/gcg-、ins-/gcg+和ins+/gcg+細胞群體定量的柱形圖(左)和顯示體外葡萄糖刺激的胰島素分泌結果的柱形圖(右)。(a)hesc系的分化。(b)人ipsc系c7的分化。

301、圖13顯示了短方案與兩個已公開的scrna測序方案之間的比較結果。h1細胞使用短方案進行分化，并在s6結束時進行scrnaseq。(a)短方案和兩個已公開方案的說明。顯示了每個階段的持續時間、因子和2d/3d培養系統。(b)umap與細胞類型預測(上)以及預測的細胞類型中標志物基因ins和gcg的表達水平(下)。

302、圖14顯示了冷凍的s5?ep細胞能夠生成s6胰島樣聚集體。hs980和h1細胞在ln-521包衣的2d表面上朝向s5分化。進入s5四天時后，細胞解離為單細胞，然后維持在3d懸浮液中以生成s6聚集體。可替代地，將單細胞冷凍并保存在液氮中。為了生成3d聚集體，將冷凍的s5細胞解凍并在3d懸浮液中培養。在s6結束時檢查標志物ins和gcg的表達以及體外葡萄糖刺激的胰島素c肽釋放。顯示了顯示ins+/gcg-、ins-/gcg+和ins+/gcg+細胞群體定量的柱形圖(左)和顯示體外葡萄糖刺激的胰島素分泌結果的柱形圖(右)。結果是根據多個獨立實驗計算的。在microsoft?excel中進行未配對的2尾t檢驗。*p<0.05，**p<0.01。

303、實施例

304、概述：本實施例證明了本文披露的本發明方法，該方法包括在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時，例如72小時或48小時的步驟，導致內分泌前體細胞的數量增加，這些內分泌前體細胞具有發育為成熟胰腺β細胞的能力。

305、材料和方法

306、hesc培養

307、hesc系hs980是在如前所述的無異源物質和限定條件下衍生的(rodin,s.,等人2014)。hesc系wa01/h1和wa09/h9獲自威斯康星細胞研究所(wicell?research?institute)(麥迪遜,威斯康星州)。人ipsc系ctrl-7-ii(c7)描述于kele?m等人.,2016)。將hesc系維持在5％?co2、5％?o2和100％濕度的37℃培養箱中的包被有10μg/ml人重組層粘連蛋白(ln)-521(柏奧萊明納公司(biolamina)，瑞典；ln-521)的賽多公司(sarstedt)多孔細胞培養板上的nutristem?hpsc?xf培養基(生物工業公司(biological?industries)，以色列；05-100-1a)中。每3-5天以12000-24000個細胞/cm2進行酶促傳代hesc。

308、對于常規傳代，將ln-521上的hesc培養物在不含ca2+和mg2+的d-pbs(賽默飛世爾科技公司(thermo?fisher)；14190169)中短暫洗滌，并與gibco?tryple?select(賽默飛世爾科技公司；a1285901)在37℃下溫育5分鐘。通過使用p1000移液器輕輕移液5-10次，將細胞收集到新鮮的nutristem?hpsc?xf培養基中，以300g離心4-5分鐘，重懸到新鮮的nutristem?hpsc?xf培養基中，并接種到新包被的細胞培養板上。

309、hesc的體外胰腺分化

310、這里描述的逐步胰腺分化方案是從以前公開的方案(pagliuca等人,2014；rezania等人,2014；millman等人,2016；vegas等人,2016)修改的。

311、將hesc系h1、h9和hs980以24000個細胞/cm2接種到ln-521包被的細胞培養板上的nutristem?hpsc?xf培養基中。四天后開始胰腺分化，達到95％-100％的融合度。分化細胞培養物維持在37℃、5％?co2、20％?o2和100％濕度培養箱中。

312、分化可分為六個階段，從s1到s6，每個階段使用的培養基如下：

313、s1培養基：mcdb131(賽默飛世爾科技公司；10372019)+25mm?nahco3(西格瑪公司(sigma)；s6297)+1x?glutamax(賽默飛世爾科技公司；35050038)+50u/ml青霉素-鏈霉素(賽默飛世爾科技公司；15140122)+2.5mm?d-葡萄糖(8mm最終濃度，西格瑪公司；g8769)+0.2％或0.5％無脂肪酸牛血清白蛋白(faf-bsa，西格瑪公司；a8806)。

314、s2培養基：mcdb131+25mm?nahco3+1x?glutamax+50u/ml青霉素-鏈霉素+2.5mm?d-葡萄糖(8mm最終濃度)+0.2％或0.5％?faf-bsa+0.25mm維生素c(西格瑪公司；a4544)。

315、s3培養基：mcdb131+25mm?nahco3+1x?glutamax+50u/ml青霉素-鏈霉素+2.5mm?d-葡萄糖(8mm最終濃度)+0.5％?faf-bsa+0.25mm維生素c+1:200its-x(賽默飛世爾科技公司；51500056)。

316、s5培養基：mcdb131+25mm?nahco3+1x?glutamax+50u/ml青霉素-鏈霉素+14.5mmd-葡萄糖(20mm最終濃度)+0.5％?faf-bsa+1:200its-x+10μm?znso4(西格瑪公司；z0251)+10μg/ml肝素(西格瑪公司；h3149)。

317、s6培養基：cmrl(賽默飛世爾科技公司；11530037)+14mm?nahco3+1x?glutamax+50u/ml青霉素-鏈霉素+14.5mm?d-葡萄糖(20mm最終濃度)+1％?faf-bsa+1:200its-x(持續三周)+10μm?znso4+10μg/ml肝素+1x?neaa(賽默飛世爾科技公司；11140035)。

318、短分化方案

319、階段1定形內胚層(3天)：將未分化的h1、h9和hs980細胞用含有ca2+和mg2+的d-pbs(賽默飛世爾科技公司；14040091)沖洗一次，然后在s1培養基中用5μm?chir99021(托克里斯公司(tocris)；4423)和100ng/ml激活素a(研究與開發公司(r&d)；338-ac)誘導24小時。在接下來的兩天，每天用僅含有100ng/ml激活素a的s1培養基補給細胞。s1培養基中faf-bsa的濃度對于hs980細胞為0.2％，對于h1和h9細胞為0.5％。

320、階段2原始腸管(3天)：將細胞用s2培養基中的50ng/ml?kgf(研究與開發公司；251-kg)誘導三天。faf-bsa濃度針對hs980細胞為0.2％，針對h1和h9細胞為0.5％。

321、階段3后前腸(1天)：在s3培養基中用50ng/ml?kgf、2μm視黃酸(西格瑪公司；r2625)、0.25μm?sant-1(西格瑪公司；s4572)、0.5μm?pdbu(托克里斯公司；4153)和200nmldn193189(托克里斯公司；6053)誘導細胞24小時。

322、階段4胰腺祖細胞(2或3天)：在s3培養基中用50ng/ml?kgf、100ng/ml?egf(研究與開發公司；236-eg)、5ng/ml激活素a、10mm煙酰胺(西格瑪公司；n0636)、100nm視黃酸、0.25μm?sant-1、0.5μm?pdbu和200nm?ldn193189誘導細胞3天。為了分析階段4的持續時間影響，細胞在此步驟中也分化了1-5天。

323、階段5內分泌祖細胞(5天)：在s5培養基中用20ng/ml乙胞素(研究與開發公司；261-ce)、100nm視黃酸、0.25μm?sant-1、100nm?gsi-xx(西格瑪公司；565789)、10μm?alk5抑制劑ii(凱曼化學公司(cayman?chemical)；14794)、1μm?gc-1(托克里斯公司；4554)和100nm?ldn193189誘導細胞。

324、進入階段5四天時，將細胞用不含ca2+和mg2+的dpbs沖洗一次，用accutase在37℃下處理10分鐘，然后通過使用p1000移液器多次移液，在s5培養基中解離為單細胞。通過以300g離心5分鐘沉淀單細胞，然后以1.0-1.5x?106個細胞/ml重懸于補充有10μm?h1152(托克里斯公司；2414)和其他因子的s5培養基中。為了生成胰島樣聚集體，將細胞轉移至超低附著6孔板(康寧公司(corning)；3471)，每孔4ml中總共4-6x?104個細胞，并在定軌搖床(infors?ht?celltron)上以95rpm在培養箱中溫育過夜。

325、為了研究rock抑制劑h1152對細胞存活和聚集體形成的影響，將不同濃度的h1152(0μm至10μm)添加至單細胞懸浮液中一天。

326、階段6(4周)：將細胞聚集體維持在進一步補充有10μm?h1152、1μm?gc-1、10μmtrolox(默克密理博公司(merck?millipore)；648471)和1mm?n-乙?；?l-半胱氨酸(西格瑪公司；a9165)的s6培養基中。三周后，its-x和h1152從培養基中去除。將聚集體保持在以95rpm的定軌搖床上的培養箱中。

327、從階段1到階段5每天更換培養基，在階段6期間每2-3天更換培養基。

328、長分化方案：

329、使用與上述短方案相同的因子和培養基使hesc朝向內分泌祖細胞分化，但階段3和階段4的持續時間分別為2天和5天。

330、階段5內分泌祖細胞的冷凍

331、進入s5四天時，細胞如上所述解離為單細胞。這些單細胞通過以300g離心5分鐘沉淀，然后以1x?107個細胞/ml重懸于冷stem-cellbanker?gmp級溶液(安姆斯生物公司(amsbio)，11924)中。將細胞懸浮液分散到nunc低溫管(賽默飛世爾科技公司；377267)中，每管總共1-1.5ml，并使用mr.frosty冷凍容器(賽默飛世爾科技公司；5100-0001)冷卻至-80℃。對于受控冷卻，可使用可編程冷卻裝置以每分鐘1℃冷卻細胞。為了長期冷凍保存，將低溫管轉移至液氮儲存。

332、階段5內分泌祖細胞的解凍

333、將冷凍管中的冷凍的s5細胞從液氮儲存中取出并在37℃下快速解凍。將每1ml細胞懸浮液稀釋并輕輕混入5ml預熱的完全s5培養基中。這些細胞通過300g離心5分鐘沉淀，然后以1.0-1.5x?106個細胞/ml重懸于完全s5培養基中。如上所述進行進一步的分化程序。

334、微孔中的聚集體形成

335、為了在微孔中生成胰島樣聚集體，如上所述將s5細胞解離成單細胞。將這些單細胞以1.5x?106個細胞/ml重懸，然后接種到aggrewell?400?6孔板(干細胞技術公司(stemcell?technologies)；34421)中，每孔4ml中總共6x?104個細胞?？商娲?，將50μl中的104個單細胞接種到96孔microtest板(賽多公司，82.1583.001)的每個孔中。然后將細胞在培養箱中培養過夜。

336、如上所述分化為s6胰島樣細胞聚集體。將聚集體保持在aggrewell?400?6孔板中，無需振蕩。

337、聚集體和細胞計數

338、在明場顯微鏡下對s6胰島樣聚集體進行計數。然后將聚集體在不含ca2+和mg2+的d-pbs中沖洗一次，并與accutase在37℃下溫育15分鐘。通過使用p1000移液器多次移液將聚集體解離為單細胞，以300g離心4-5分鐘，并重懸于不含ca2+和mg2+的d-pbs中。使用orflomoxi?z迷你自動細胞計數器(orflo公司；mxz001)對細胞數量進行計數。

339、流式細胞術

340、通過在37℃下用accutase處理15分鐘，將細胞解離為單細胞。然后將細胞洗滌兩次，并以106個細胞/ml重懸于不含mg2+和ca2+的d-pbs中。使用活/死可固定死細胞染色試劑盒(賽默飛世爾公司；l34963和l34965)將細胞在冰上溫育30分鐘。用不含mg2+和ca2+的d-pbs洗滌兩次后，用bd生物科學公司(bd?bioscience)cytofix/cytoperm緩沖液(554722)在冰上固定細胞20分鐘。然后將細胞在1x?bd生物科學公司透化/洗滌緩沖液(554723)中洗滌兩次，并與在1x?bd生物科學公司透化/洗滌緩沖液中稀釋的綴合抗體在冰上溫育30分鐘。在1x?bd生物科學公司透化/洗滌緩沖液中洗滌兩次后，將細胞重懸于facs緩沖液(不含ca2+或mg2+的d-pbs，含有2％胎牛血清(賽默飛世爾科技公司；10082147)和1mm?edta(賽默飛世爾科技公司；15575020))并使用貝克曼庫爾特公司(beckman?coulter)cytoflex?s流式細胞儀進行分析。使用bd生物科學公司flowjo?v10.8軟件分析流式細胞術數據。綴合的抗體均購自bd生物科學公司：alexa?fluor?647小鼠抗胰島素(1/20，565689)、pe小鼠抗胰高血糖素(1/20，565860)、alexa?fluor?488小鼠抗人生長抑素(1/20，566032)、pe小鼠抗neurod1(1/20，563001)、alexa?fluor?647小鼠抗nkx6.1(1/20，563338)、alexa?fluor?488小鼠抗pdx-1(1/20，562274)和v450小鼠抗ki-67(1/20，561281)。

341、免疫熒光

342、將細胞用4％(wt/vol)多聚甲醛在室溫(rt)下固定20分鐘，并隨后用不含mg2+和ca2+的d-pbs洗滌三次。對于免疫染色，用含有0.3％(vol/vol)triton?x-100(西格瑪公司；t9284)的d-pbs(不含mg2+和ca2+)中的5％正常驢血清(默克密理博公司；s30-100?ml)在rt下封閉細胞1小時，然后與在含有0.1％(vol/vol)triton?x-100或tween?20(西格瑪公司；p9416)和5％正常驢血清的d-pbs(不含mg2+和ca2+)中稀釋的一抗在4℃下溫育過夜。第二天，將細胞與二抗在室溫下溫育1小時。每個溫育步驟后，用不含mg2+和ca2+的d-pbs洗滌細胞三次。使用的一抗如下：山羊抗人pdx-1(1/300，研究與開發公司；af2419)、小鼠抗nkx6.1(1/100，dshb；f55a12-s)，綿羊抗人神經生成素3(ngn3)(1/100，研究與開發公司；af3444)，山羊抗人/小鼠neurod1(1/100，研究與開發公司；af2746)、豚鼠抗c肽(1/100，艾博抗公司(abcam)；ab30477)、大鼠抗c肽(1/50，dshb；gn-id4-s)、小鼠抗胰高血糖素(1/1000，西格瑪公司；g2654)和兔抗生長抑素(1/500，西格瑪公司；332a-1)。

343、體外葡萄糖刺激

344、在階段6結束時，二十至三十個hesc衍生的聚集體在不含its-x和另外葡萄糖(最終為5mm)的s6培養基中溫育過夜。第二天，將聚集體轉移至24孔超低附著板(康寧公司；3473)，并用2ml?krebs緩沖液(129mm?nacl、4.8mm?kcl、2.5mm?cacl2、1.2mm?mgso2、1mmna2hpo4、1.2mm?kh2po4、5mm?nahco3、10mm?hepes和0.1％?faf-bsa)洗滌兩次。然后將聚集體在含有2mm葡萄糖的2ml?krebs緩沖液中預溫育2小時以去除殘留的胰島素。之后，將聚集體用2ml?krebs緩沖液洗滌兩次，然后在含有2mm葡萄糖的2ml?krebs緩沖液中溫育30min。溫育后收集500μl上清液樣品(低葡萄糖樣品)。將聚集體用2ml?krebs緩沖液洗滌一次，然后在含有20mm葡萄糖的2ml?krebs緩沖液中溫育30min。溫育后收集500μl上清液樣品(高葡萄糖樣品)。將聚集體在2ml?krebs緩沖液中洗滌兩次，然后再次在含有2mm葡萄糖的2mlkrebs緩沖液中溫育30min。收集500μl上清液樣品(低葡萄糖樣品)。將聚集體在2ml?krebs緩沖液中洗滌一次，然后在含有2mm葡萄糖和30mm?kcl(極化刺激)的2ml?krebs緩沖液中溫育30min。收集500μl上清液樣品(kcl刺激樣品)。在kcl刺激后，通過用accutase處理15分鐘將聚集體分散為單細胞，并使用orflo?moxi?z細胞計數器對細胞總數進行計數。使用人c肽elisa試劑盒(研究與開發公司；dicp00)處理收集的含有分泌的胰島素的上清液樣品。人胰島素c肽測量值通過總細胞數歸一化，并表示為從103個細胞釋放的pmol?c肽。如果當天未進行elisa，則將樣品保存在-80℃。

345、scrna測序樣品制備

346、在s6結束時收集hesc衍生的胰島進行scrna測序。將胰島樣聚集體在不含ca2+和mg2+的d-pbs中沖洗兩次，并與tryple在定軌搖床上于37℃下溫育15-20分鐘。通過使用p1000移液器多次移液將聚集體解離為單細胞，以300g離心4-5分鐘，重懸于含有0.04％faf-bsa的d-pbs(不含ca2+和mg2+)中，然后使用40μm細胞過濾器(威達優爾公司(vwr)，732-2760)過濾。為了確定總細胞數和活細胞比率，用0.4％臺盼藍溶液(賽默飛世爾科技公司，15250061)對單細胞懸浮液進行染色，并使用血細胞計數器進行計數。

347、單細胞rna測序分析

348、使用3000個細胞構建scrna測序文庫。使用10x?genomics?chromium?next?gem單細胞3′試劑盒v3.1(10x基因組學公司(10x?genomics)，cg000315或cg000388)，有時與細胞多重寡核苷酸標記方案(10x基因組學公司，cg000391)一起使用，隨后在illumina?nextseq2000機器上進行rna測序。為了生成fastq文件和特征條形碼矩陣，在cell?ranger?3.1.0中執行分析步驟。執行統一流形逼近和投影(umap)，用于降維、細胞類型鑒定和差異基因表達分析。

349、實施例1

350、在該實施例中，使用不同hesc系對細胞培養基底支持胰腺分化的能力進行了比較。根據階段4(s4)的胰腺祖細胞(pp)和階段5(s5)的內分泌祖細胞(ep)的表達關鍵標志物評價胰腺分化。

351、已經制定了在包被飼養細胞或基質膠的2d表面上培養的hpsc的體外胰腺分化的方案(pagliuca等人2014；d’amour等人,2006；kroon等人,2008)。然而，對于hpsc衍生的胰島的臨床應用，高度優選無異源物質的化學成分確定的包被基底。因此，我們比較了在基質膠情況下人重組ln-511和ln-521支持胰腺分化的能力。使用長分化方案在這三種基底上分化hesc系hs980和h1(參見上分圖圖1b)，并在s4結束時和進入s5四天時通過流式細胞術測量關鍵祖細胞標志物pdx1、nkx6.1和neurod1的表達。

352、結果：結果顯示，在hs980和h1細胞系中，s4?pdx1+/nkx6.1+胰腺祖細胞(pp)的百分比在所有基底上均相當(圖2a)。然而，pdx1+/nkx6.1+細胞的水平在基質膠上顯著下降，在ln-511上的下降程度較小，但當s4細胞進一步向s5分化時，在ln-521上保持相對穩定(圖2b)。與基質膠上的相比，ln-521上的s5?nkx6.1+/neurod1+內分泌祖細胞(ep)的百分比高得多，而ln-511上的百分比在較小程度上也更高(圖2c)。

353、綜上所述，數據表明基質膠、ln-511和ln-521能夠支持分化為s4?pp細胞，尤其是ln-521還為s4?pp細胞的內分泌分化提供了允許的表面環境。因此，我們決定在ln-521而不是基質膠上繼續我們的所有實驗。由于ln-521上s5ep細胞的百分比僅為20％-30％，因此需要進行修改以優化分化方案。

354、實施例2

355、在該實施例中，研究了階段4持續時間對內分泌分化的影響。

356、階段3不同長度的評價

357、此前已有報道，短持續時間的s3促進s4?pdx1+/nkx6.1+pp細胞群體并抑制未成熟的多激素細胞群體(nostro等人,2015)。然而，尚不清楚s4的持續時間是否也會以類似的方式影響后期的分化階段。因此，我們決定分析/優化s3和s4的持續時間。為了鑒定s3的最短持續時間，將hs980和h1細胞分化為s3后前腸細胞(pf)，并在s2結束時以及進入s3?1或2天時測量關鍵pf標志物pdx1的表達。

358、結果：結果顯示，進入s3?1天后，pdx1已在大多數細胞中表達，并且如通過免疫細胞學分析和顯示培養第6、7和8天時pdx1+細胞數量的代表性斑點印跡所示，該表達僅在2天后略有增加(圖3)。

359、因此，數據顯示s3的一天持續時間足以使s2?pgt細胞分化為s3?pdx1+pf細胞。兩天的持續時間也導致大量s3?pdx1+pf細胞。因此，得出結論s3的持續時間至多應為48小時，例如24小時。

360、階段4持續時間對分化為內分泌祖細胞的影響

361、為了分析s4持續時間對s5?ep分化的影響，在s3下誘導hs980、h1和h9細胞1天，然后在s4下誘導1、2、3、4或5天(如圖4a中示意圖所示)。

362、結果：在s4結束時然后在進入s5四天時測量nkx6.1和neurod1的表達(代表性點圖分別顯示在圖4b的上分圖和下分圖中)。結果顯示，當hs980細胞的s4持續時間從2天增加至5天時，s4?nkx6.1+pp細胞的百分比大幅增加。相反，s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞的百分比隨著s4持續時間的增加而減少(圖4b)。對于h1和h9細胞也觀察到類似的抑制作用。當持續時間超過2-3天時，nkx6.1+/neurod1+ep細胞的百分比開始下降(圖4c)。將實驗重復幾次，且結果表明，在s4下的2-3天對于隨后分化為s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞是最佳的(圖4d)。相反，s4下持續時間的增加在s5時生成顯著更高百分比的nkx6.1+/neurod1-細胞(圖4d)。nkx6.1+/neurod1-細胞很可能實際上是s4?nkx6.1+pp細胞，由于長持續時間的抑制作用，未能進一步分化為s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞(圖4d)。長s4持續時間的抑制作用在h9細胞中尤其明顯，并且從5天減少至2天，這將總neurod1+內分泌細胞的百分比增加至hs980和h1細胞中類似的水平(圖4e)。結果還表明，s4下1天不足以誘導nkx6.1(圖4e)。

363、因此，得出結論，2-3天的s4持續時間允許更高百分比的nkx6.1+/neurod1+ep細胞，并且因此有益于分化為s5?ep細胞。最佳的s4持續時間還可使胰腺分化過程中的細胞系變異最小化。

364、階段4持續時間對胰島細胞成熟的影響

365、還分析了s4持續時間對s6胰島細胞成熟的影響。為了生成s6胰島樣細胞聚集體，將來自不同s4持續時間的s5?ep細胞解離為單細胞，然后如上所述維持在懸浮液中。在s6結束時分析關鍵標志物胰島素(ins)和胰高血糖素(gcg)的表達。

366、結果：結果表明，當s4持續時間變成長于3天時，ins+單激素β細胞的百分比下降，且gcg+單激素α細胞的百分比顯著增加，如代表性點圖(圖4e)和柱形圖(圖4f)所示。值得注意的是，s4的2天持續時間導致h1細胞培養物和h9細胞培養物中的高百分比ep細胞，而s4的3天持續時間導致h980培養物中的高百分比ep細胞(圖4d)。然而，3天的持續時間導致s6ins+β細胞的百分比最高(圖4f)。

367、總而言之：綜上所述，這些結果表明，長s4持續時間促進分化為s4nkx6.1+pp細胞，但抑制進一步分化為s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞。另一方面，短s4持續時間生成較少的s4nkx6.1+pp細胞，但增加了s5nkx6.1+/neurod1+ep細胞。結果還表明，s4持續時間對α和β細胞群體具有相反的影響。s4下3天持續時間促進ins+β細胞，5天持續時間強烈促進gcg+α細胞。重要的是，該結果在三種不同的hesc系(h1、h9和hs980)中得到了證實。

368、實施例3

369、在該實施例中，評價了用于胰腺分化的不同細胞培養包被基底。

370、化學成分確定且無異源物質的細胞培養基底(例如ln-521)可為多能干細胞的擴增和分化提供更一致和可靠的條件。為了確定hesc是否也可以在其他基質蛋白上分化為胰腺內分泌細胞，我們將hs980、h1和h9細胞傳代至包被有基質膠(1/100，康寧公司；354277)或人重組ln-111、ln-121、ln-211、ln-221、ln-332、ln-411、ln-421、ln-511或ln-521(均獲自柏奧萊明納公司)的細胞培養板上。hs980、h1和h9細胞附著于ln-111、ln-121、ln-332、ln-421、ln-511、ln-521和基質膠(表2)。

371、

372、

373、表2：細胞粘附在包被不同基質蛋白的2d表面上。hs980、h1和h9細胞傳代到包被不同重組人層粘連蛋白同種型(ln)或基質膠的板上，如表中所示。3-4天后在顯微鏡下檢查細胞粘附和存活。+表示細胞在底部附著并形成單層，-表示細胞未能附著至包被的表面。

374、使用短方案使細胞向s5?ep細胞分化，并在進入階段5四天時分析nkx6.1和neurod1的表達(圖5a)。結果表明，ln-332、ln-521和ln-511比基質膠更有效地支持分化為s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞(圖5a、圖5b)。值得注意的是，當使用短方案代替長方案時，ln-511與ln-521一樣有效地增強hs980和h1細胞的s5?ep分化(圖5a、圖5b)。h1細胞也在包被10μg/ml纖連蛋白(fn，sigma；f0895)或玻連蛋白(vtn，sigma；5051)的板上進行分化。結果表明，fn和vtn能夠支持s5?ep分化(圖5b)。

375、選擇在ln-332、ln-511、ln-521和基質膠上生成的s5?ep細胞用于進一步朝向如上所述的s6胰島細胞分化。在s6結束時測量ins和gcg的表達。結果表明，來自這些基底的s5ep細胞能夠生成s6單激素ins+β細胞和gcg+α細胞(圖5c)。

376、總而言之，結果表明，短方案對多種無異源物質的確定的基底非常有效。

377、實施例4

378、在該實施例中，研究了s4或s5細胞是否更適合體外形成胰島。

379、在之前的報道中，純化的s4?pp細胞已用于生成胰島(cogger等人,2017；ameri等人,2017；kelly等人,2011)。為了確定哪種細胞群體更適合胰島形成，在s4結束時或進入s54天時將hs980細胞解離為單細胞。然后將細胞保持懸浮狀態以生成胰島狀聚集體(圖6a)。在s6結束時分析關鍵內分泌標志物ins和gcg的表達、胰島樣聚集體的數量和胰島細胞的數量。

380、結果：結果表明，由s5?ep細胞生成的聚集體比來自s4?pp細胞的聚集體具有高得多的百分比的ins+β細胞和gcg+α細胞兩者(圖6b)。s5?ep細胞還生成比s4?pp細胞多超過10倍的胰島樣聚集體和胰島細胞(圖6b)。

381、為了確定較長的s5持續時間是否改善胰島形成，將s5?ep細胞在進入s5?6天時解離為單細胞，然后維持在3d懸浮液中。然而，α和β細胞的百分比保持不變，并且聚集體/細胞的數量在s6時反而減少(圖6b)。

382、綜上所述，這些數據表明，s5?ep細胞而非s4?pp細胞在3d懸浮液中有效形成胰島樣聚集體，并且在s5下4天的持續時間對于懸浮液中的聚集體形成是足夠的。

383、實施例5

384、在該實施例中，研究了3d單細胞懸浮液中細胞培養的效果。

385、為了確定3d單細胞懸浮液是否選擇性促進來自s5?ep細胞的聚集體的形成，將hs980和h1細胞在ln-521上分化為s5?ep細胞，然后在3d懸浮液中解離為單細胞。在3d懸浮液中聚集體形成之前和之后分析nkx6.1、neurod1和細胞增殖標志物ki-67的表達。

386、結果：結果顯示，與在第14天時的2d細胞相比，在第15天時，新形成的聚集體中s5nkx6.1+/neurod1+和總neurod1+細胞的百分比明顯增加，并且3d聚集體中neurod1-非內分泌細胞的百分比大幅下降(圖7a)。結果還顯示，s5?neurod1+ep細胞為非增殖型ki-67-細胞，且大多數增殖型ki-67+/neurod1-和非增殖型ki-67-/neurod1-細胞在3d懸浮液中形成聚集體期間被去除(圖7b)。

387、為了確定s5?ep細胞存活和聚集體形成是否需要rock抑制劑，將不同濃度的h1152(0μm至10μm)添加至3d單細胞懸浮液中一天。在3d懸浮液中聚集體形成后一天，測量nkx6.1、neurod1和ki-67的表達以及聚集體細胞數量。

388、結果：結果表明，h1152的濃度對新形成的聚集體中s5?ep細胞的百分比沒有影響(圖7c)。然而，在低濃度的h1152存在的情況下，胰島細胞的數量顯著增加，表明h1152促進s5?ep細胞作為懸浮液中的單細胞存活(圖7d)。

389、綜上所述，這些結果表明，由于從單細胞形成3d聚集體，s5?ep細胞選擇性富集，這與先前對胎兒胰腺發育的研究一致(gouzi等人,2017)。

390、實施例6

391、在該實施例中，通過比較獲得的胰腺祖細胞(pp)和內分泌祖細胞(ep)的百分比，對短胰腺分化方案和長胰腺分化方案進行了比較。

392、接下來，我們比較了短方案和長方案。使用如上所述的短分化方案和長分化方案使ln-521上的hs980細胞朝向s5?ep細胞分化(如圖1b所示)。在s3、s4結束時和進入s5四天時(短方案的分化第7、10和14天，長方案的分化第8、13和17天)分析關鍵祖細胞標志物的表達。

393、結果：結果顯示短方案和長方案的效果相反。短方案生成的s4?nkx6.1+pp細胞的百分比低于長方案，但s5?nkx6.1+/neurod1+ep細胞的百分比高于該長方案(圖8a和圖8b)。s5時，短方案的nkx6.1+/neurod1-非內分泌細胞百分比低于長方案(圖8a和8b)。這些結果共同表明短s3+s4持續時間對s5ep分化有積極影響。

394、為了確定s3+s4持續時間是否也影響s6期間的胰島成熟，將s5?ep細胞解離為單細胞，然后如上所述維持在懸浮液中。在s6結束時分析關鍵內分泌標志物ins和gcg的表達、胰島樣聚集體和胰島細胞的數量以及體外葡萄糖刺激的胰島素分泌(圖8c和圖8d)。

395、結果：結果表明，短方案誘導的ins+單激素β細胞的百分比高于長方案，但gcg+單激素α細胞的百分比低于長方案(圖8c)。在h1細胞中也觀察到s3+s4持續時間的類似影響(圖8c)。短方案還比長方案生成更多數量的胰島樣聚集體和胰島細胞(圖8d)。體外葡萄糖刺激實驗的結果證實，s6結束時的聚集體功能完整，并且可以應答于高葡萄糖濃度使胰島素分泌增加10倍，但使用短方案生成的聚集體在高葡萄糖水平下分泌更多胰島素(圖8d)。總而言之，這些結果表明，短s3+s4持續時間對s6期間胰島的成熟有強烈的積極影響。

396、還使用免疫細胞化學(icc)分析了階段特異性標志物的表達(圖9)。長方案在s4處誘導出非常致密的層，其主要包含pdx1+/nkx6.1+pp細胞(圖9a)。相反，短方案誘導較少的s4pdx1+/nkx6.1+pp細胞，一些細胞仍維持nkx6.1-(圖9a)。兩種方案均在s4時觀察到nkx6.1-細胞中neurod1的過早誘導(圖9a)。進一步分化為s5?ep細胞顯示出相反的影響。短方案比長方案生成更多的s5?nkx6.1+/neurod+ep細胞(圖9b)。結果還表明，使用短方案和長方案生成的聚集體具有β細胞和α細胞之間不同的比率(圖9c)。短方案誘導更多的胰島素c肽(cpep)陽性β細胞，并且長方案誘導更多的gcg+α細胞(圖9c)。還觀察到一些生長抑素(sst)陽性δ細胞(圖9c)。綜上所述，icc的結果支持了上述流式細胞術分析的結論。

397、實施例7

398、在該實施例中，研究了s5細胞自發聚集成3d培養物與使用aggrewell?400板和96孔板強制聚集相比對單激素胰腺β細胞生成的影響。

399、對于自發聚集，h1細胞在s5時解離成單細胞并如上所述維持在3d懸浮液中。對于微孔中的強制聚集，s5細胞被轉移到aggrewell或96孔板中。在3d聚集后一天和再在s6結束時通過流式細胞術研究生成的細胞的身份。

400、結果：結果表明，微孔中生成的聚集體主要含有nkx6.1+/neurod1+/ki-67-ep細胞，因為聚集體在3d懸浮培養中自發生成(圖10a、圖10b)。增殖型ki-67+細胞從微孔中的聚集體中去除，就像在3d懸浮液中一樣(圖10a、圖10b)。在s6結束時，微孔中生成的聚集體含有與自發生成的聚集體類似的ins+β細胞和gcg+α細胞百分比(圖10c)。這些聚集體中僅剩下極少數ki-67+增殖型細胞(圖10c)。

401、綜上所述，這些結果表明s5?ep細胞可以與其他非內分泌細胞類型分離，然后進行自發自我聚集。

402、實施例8

403、在該實施例中，在使用短胰腺分化方案分化的多個hpsc系中評價了細胞系變異性。

404、hesc系hs980、h1和h9分化為如上所述的s6胰島細胞。在s6結束時分析了關鍵標志物ins和gcg的表達，以及體外葡萄糖刺激的胰島素分泌。為了確定短分化方案是否也適用于人ipsc系，在ln-521上分化c7細胞，并在s5和s6結束時檢查了關鍵標志物的表達。

405、結果：結果表明，在所有三種hesc系中，單激素ins+β細胞和gcg+α細胞的百分比相當，并且聚集體是有功能的，并且可以以類似的方式應答于高葡萄糖濃度增加胰島素分泌(圖12a)。結果還表明，人ipsc系可以成功分化為s5nkx6.1+/neurod1+ep細胞，且隨后分化為s6單激素ins+β細胞和gcg+α細胞(圖12b)。

406、總而言之，這些結果顯示使用短胰腺分化方案分化的多個人esc和ipsc系之間的細胞系變異性相對較低。

407、實施例9

408、在該實施例中，使用單細胞rna測序(scrnaseq)實驗的數據集將短胰腺分化方案與先前公開的兩個方案(augsornworawat等人2020和balboa等人2022)進行了比較(圖13a)。

409、使用如上所述的短胰腺分化方案使h1細胞分化為s6胰島細胞。在s6結束時通過單細胞rna測序研究了胰島細胞的基因表達譜。獲得的數據集通過umap投影進行處理和可視化(圖13b)。分析了每個細胞群體中的細胞類型身份和關鍵標志物基因的表達(圖13b)。分析中還包括兩個已公開的數據集(augsornworawat等人2020和balboa等人2022)。

410、結果：結果表明，使用短分化方案生成的s6胰島含有兩個成熟的單激素細胞群體，表達ins的β細胞和表達gcg的α細胞(圖13b，左)。通過augsornworawat等人生成的胰島還包含兩個主要的內分泌細胞群體(圖13b，中)。然而，大多數細胞共表達ins和gcg兩者，并且因此是未成熟的多激素β和α細胞。相反地，來自balboa等人的胰島含有內分泌和非內分泌細胞類型兩者，盡管預測的β和α是單激素的(圖13b，右)。

411、總而言之，這些結果表明，通過短胰腺分化方案生成的胰島主要含有成熟的單激素β和α細胞。相比之下，最近公開的兩個方案生成的胰島含有未成熟的多激素細胞或非內分泌細胞。

412、實施例10

413、在該實施例中，比較了冷凍和未冷凍的s5?ep細胞生成3d胰島的能力。

414、如上所述，hs980和h1細胞朝向s5分化。細胞在3d懸浮液中解離成單細胞，然后進一步朝向s6分化?？商娲?，將s5單細胞冷凍并保存在液氮中。隨后將冷凍的細胞解凍并如上所述朝向s6分化。在s6結束時檢查胰島細胞的身份和體外葡萄糖刺激的胰島素釋放。

415、結果：結果顯示，s5時的冷凍/解凍過程并未改變hs980和h1細胞中ins+β細胞的百分比(圖14，左)。冷凍/解凍程序后，hs980細胞中gcg+α細胞的百分比顯著下降，但h1細胞沒有(圖14，左)。結果還表明，從s5?ep細胞(無論是冷凍的還是未冷凍的)分化而來的胰島均是有功能的，并且可以應答于高葡萄糖水平增加胰島素釋放(圖14，右)。

416、綜上所述，這些結果表明s5?ep細胞可以冷凍保存，并且冷凍的細胞是體外生產功能性胰島的理想來源。

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432、實施方案清單

433、1.一種用于生成胰腺內分泌譜系細胞，例如胰腺β細胞譜系細胞的方法，該方法包括以下的步驟a)-c)：

434、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

435、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時，例如不超過大約72小時；以及

436、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞。

437、2.如項目1所述的方法，其中在步驟b)中，將所述細胞群體培養大約42至78小時的時間段，例如大約44至76小時的時間段，例如大約46至74小時的時間段，例如大約48至72小時的時間段。

438、3.如項目1或2所述的方法，其中在步驟b)中，將所述細胞群體培養大約66至78小時的時間段，例如大約68至76小時的時間段，例如大約70至74小時的時間段，例如大約72小時的時間段。

439、4.如項目1或2所述的方法，其中在步驟b)中，將所述細胞群體培養大約42至54小時的時間段，例如大約44至52小時的時間段，例如大約46至50小時的時間段，例如大約48小時的時間段。

440、5.如項目1至4中任一項所述的方法，其中在步驟c)中，所述胰腺祖細胞的細胞群體，例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞的細胞群體，進一步以表達選自由以下組成的組的至少一種標志物為特征：ptf1a、sox9、hnf6和cpa，例如選自由以下組成的組的標志物：ptf1a和sox9。

441、6.如項目1至5中任一項所述的方法，其中步驟b)包括在以下情況下在培養基中培養所述細胞群體：存在有效量的表皮生長因子(egf)，例如人egf或其衍生物或激動劑；以及有效量的煙酰胺(nic)或其衍生物或激動劑。

442、7.如項目1至6中任一項所述的方法，其中步驟b)包括在存在有效量的egf(例如人egf)和有效量的nic的情況下在培養基中培養所述細胞群體。

443、8.如項目6至7中任一項所述的方法，其中所述egf或其衍生物或激動劑的有效量是大約50至200ng/ml，例如大約50至150ng/ml，例如大約75至125ng/ml，例如大約100ng/ml。

444、9.如項目6至8中任一項所述的方法，其中所述nic或其衍生物或激動劑的有效量是大約5mm至20mm，例如大約5mm至15mm，例如大約8mm至12mm，例如大約10mm。

445、10.如項目1至9中任一項所述的方法，其中步驟b)包括在還包含kgf、激活素a、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的培養基中培養所述細胞群體。

446、11.如項目1至10中任一項所述的方法，其中將所述細胞在2d基底上培養，例如其中將所述細胞在2d基底上貼壁培養。

447、12.如項目1至11中任一項所述的方法，其中所述2d基底包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白及其片段、明膠及其片段、官能化絲(fn絲)、以及基質膠tm，例如一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、以及基質膠tm。

448、13.如項目12所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、ln-121及其片段、以及ln-111及其片段；

449、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、以及ln-121及其片段；

450、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、以及ln-332及其片段；

451、例如由ln-521及其片段組成的組或由ln-511及其片段組成的組。

452、14.如項目12至13中任一項所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421、ln-121和ln-111；例如由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421和ln-121，例如由以下組成的組：ln-521、ln-511和ln-332；例如由以下組成的組：ln-521和ln-511；例如其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-521或其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-511。

453、15.如項目12至13中任一項所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)和片段包含層粘連蛋白的e8片段，例如選自由以下組成的組的層粘連蛋白的e8片段：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、ln-421的e8片段、ln-121的e8片段和ln-111的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、以及ln-421的e8片段和ln-121的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段和ln-332的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段和ln-521的e8片段；例如ln-511的e8片段或ln-521的e8片段。

454、16.如項目1至15中任一項所述的方法，其中a)中至少大約60％，例如至少大約55％，例如至少大約70％，例如至少大約75％，例如至少大約80％的后前腸細胞，例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞，在c)中分化為胰腺祖細胞，例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞。

455、17.如項目1至16中任一項所述的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的至少大約75％，例如至少大約80％，例如大約80至85％，例如大約80至90％表達pdx1。

456、18.如項目1至17中任一項所述的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的至多大約10％表達neurod1。

457、19.如項目1至18中任一項所述的方法，其中在步驟c)中，總細胞群體的大約40％至70％表達nkx6.1。

458、20.如項目1至19中任一項所述的方法，其在步驟a)-c)之前包括以下的步驟a-1)–c-1)：

459、a-1)提供原始腸管細胞的細胞群體，這些原始腸管細胞是例如以表達hnf1β和/或hnf4α為特征的原始腸管細胞；

460、b-1)在允許分化為后前腸細胞的條件下培養所述原始腸管細胞的細胞群體不超過大約54小時；以及

461、c-1)從而生成后前腸細胞的群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞。

462、21.如項目20所述的方法，其中在步驟b-1)中，將所述細胞群體培養不超過大約52小時，例如不超過大約50小時，例如不超過大約48小時。

463、22.如項目20或21所述的方法，其中在步驟b-1)中，將所述細胞群體培養大約18至54小時的時間段，例如大約20至52小時的時間段，例如大約22至50小時的時間段，例如大約24至48小時的時間段。

464、23.如項目20-22中任一項的方法，其中在步驟b-1)中，將所述細胞群體培養大約42至54小時的時間段，例如大約44至52小時的時間段，例如大約46至50小時的時間段，例如大約48小時。

465、24.如項目20-22中任一項的方法，其中在步驟b-1)中，將所述細胞群體培養大約18至30小時的時間段，例如大約20至28小時的時間段，例如大約22至26小時的時間段，例如大約24小時。

466、25.如項目20-24中任一項所述的方法，其中步驟b-1)包括在包含kgf、視黃酸、sant-1、pdbu和ldn的培養基中培養所述細胞群體。

467、26.如項目1至25中任一項所述的方法，其在步驟a)-c)之后包括以下的步驟a+1)–c+1)：

468、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞；

469、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

470、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

471、27.如項目26所述的方法，其中所述內分泌祖細胞的群體，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞的群體，進一步以表達pdx1和ngn3中的至少一種為特征。

472、28.如項目26或27所述的方法，其中在步驟b+1)中，將所述胰腺祖細胞的細胞群體培養大約3至5天，例如大約3至4天或大約4至5天，例如大約4天或例如大約5天。

473、28.如項目26至28中任一項所述的方法，其中將所述細胞在2d基底上培養至少直至在步驟c+1)中生成內分泌祖細胞。

474、29.如項目25至28中任一項所述的方法，其中所述2d基底包含一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、膠原蛋白及其片段、明膠及其片段、官能化絲(fn絲)、以及基質膠tm，例如一種或多種選自由以下組成的組的組分：層粘連蛋白(ln)及其片段、玻連蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段、以及基質膠tm。

475、30.如項目29所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、ln-121及其片段、以及ln-111及其片段；

476、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、ln-332及其片段、ln-421及其片段、以及ln-121及其片段；

477、例如由以下組成的組：ln-521及其片段、ln-511及其片段、以及ln-332及其片段；

478、例如由ln-521及其片段組成的組或由ln-511及其片段組成的組。

479、31.如項目29至30中任一項所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)及其片段選自由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421、ln-121和ln-111；例如由以下組成的組：ln-521、ln-511、ln-332、ln-421和ln-121，例如由以下組成的組：ln-521、ln-511和ln-332；例如由以下組成的組：ln-521和ln-511；例如其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-521或其中所述層粘連蛋白及其片段是ln-511。

480、32.如項目29至30中任一項所述的方法，其中所述層粘連蛋白(ln)和片段包含層粘連蛋白的e8片段，例如選自由以下組成的組的層粘連蛋白的e8片段：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、ln-421的e8片段、ln-121的e8片段和ln-111的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段、ln-332的e8片段、以及ln-421的e8片段和ln-121的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段、ln-521的e8片段和ln-332的e8片段；例如由以下組成的組：ln-511的e8片段和ln-521的e8片段；例如ln-511的e8片段或ln-521的e8片段。

481、33.如項目26至32中任一項所述的方法，其中在步驟c+1)中，總細胞群體的超過大約30％，例如超過大約40％，例如超過大約45％，例如超過大約50％是內分泌祖細胞，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

482、34.如項目1至33中任一項所述的方法，其中步驟c+1)中的內分泌祖細胞的數量與使用相應方法獲得的內分泌細胞的數量相比更高，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約24小時或更短和/或大約96小時或更長。

483、35.如項目1至34中任一項所述的方法，其中所述方法產生比相應方法多至少大約10％，例如至少大約15％，例如至少大約20％，例如至少大約30％，例如至少大約40％，例如至少50％，例如至少60％的內分泌祖細胞，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約24小時或更短和/或大約96小時或更長。

484、36.如項目26至35中任一項所述的方法，其中步驟b+1)包括在包含btc、alk5i?ii、gsi-xx、gc-1、ldn、視黃酸和sant-1的培養基中培養所述細胞群體。

485、37.如項目1至36中任一項所述的方法，其還包括在允許分化為單激素胰腺β細胞的條件中培養所述內分泌祖細胞。

486、38.如項目1至37中任一項所述的方法，其中在表現出內分泌祖細胞的特征性標志物的表達之前，不將所述細胞從2d基底上的培養轉移至3d基底上的培養，例如其中在表現出內分泌祖細胞的特征性標志物的表達之前，不將所述細胞從2d基底貼壁培養轉移至3d基底上的培養。

487、39.如項目1至38中任一項所述的方法，其在步驟a+1)–c+1)之后還包括以下的步驟a+2)–c+2)：

488、a+2)將所述內分泌祖細胞的群體，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞的群體，從2d基底上的培養轉移至3d培養條件；

489、b+2)在允許分化為胰腺單激素β細胞的條件下培養所述內分泌祖細胞的群體；以及

490、c+2)從而生成單激素β細胞的群體，這些單激素β細胞是例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞，例如其中所述胰腺單激素β細胞的群體是至少一個胰島樣細胞聚集體的一部分。

491、40.如項目39所述的方法，其中步驟b+2)包括培養所述內分泌祖細胞的群體大約2周或更長，例如大約3周或更長，例如大約3至5周，例如大約4周。

492、41.如項目38至40中任一項所述的方法，其中步驟c+2)中生成的所述單激素β細胞的群體不表達胰高血糖素或生長抑素。

493、42.如項目1至41中任一項所述的方法，其中在步驟c+2)中，總細胞群體的超過大約40％，例如大約40％至70％，例如大約40％至60％，例如大約40％至50％是單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

494、43.如項目1至42中任一項所述的方法，其中所述方法產生比相應方法多至少大約30％，例如至少大約35％，例如至少大約40％的單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞，在該相應方法中，步驟b)為在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體大約96小時或更長。

495、44.如項目1至43中任一項所述的方法，其中所述方法產生比以表達胰高血糖素為特征的單激素胰腺α細胞多至少2倍的單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

496、45.如項目1至44中任一項所述的方法，其中所述單激素β細胞是功能性胰腺β細胞，例如通過葡萄糖刺激后c肽的表達來評分的功能性胰腺β細胞。

497、46.如項目1至45中任一項所述的方法，其中步驟a)或a-1)中的細胞群體衍生自多能干細胞的培養，例如誘導性多能干細胞的培養或胚胎干細胞的培養，例如人誘導性多能干細胞的培養或人胚胎干細胞的培養。

498、47.如項目1至46中任一項所述的方法，其中步驟a)或a-1)中的所述細胞群體是哺乳動物細胞群體，例如人細胞群體。

499、48.如項目46至47中任一項所述的方法，其中步驟a)或a-1)中的所述細胞群體衍生自人胚胎干細胞群體，例如選自以下的人胚胎干細胞群體：由hs980細胞、h1細胞和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組，例如由hs980細胞和h1細胞組成的胚胎干細胞系的組，或由h1和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組，或由hs980細胞和h9細胞組成的胚胎干細胞系的組。

500、49.如項目46至47中任一項所述的方法，其中步驟a)或a-1)中的所述細胞群體衍生自人誘導性多能干細胞群體。

501、50.如項目1至25和46至49中任一項所述的方法，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是胰腺祖細胞。

502、51.如項目1至38和46至49中任一項所述的方法，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是內分泌祖細胞。

503、52.如項目1至49中任一項所述的方法，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是胰腺β細胞。

504、53.如項目1至49和51至52中任一項所述的方法，其還包括內分泌祖細胞的冷凍保存。

505、54.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，該群體能通過如前述項目中任一項所述的方法獲得。

506、55.如項目54所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，該群體尚未經受針對所期望表型的富集，例如尚未經受針對所期望表型的分選，例如基于所期望標志物表達的分選或例如基于facs的針對所期望表型的分選。

507、56.如項目54至55中任一項所述的分離的胰腺β細胞的群體，其中總細胞群體的超過大約40％，例如大約40％至70％，例如大約40％至60％，例如大約40％至50％是單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

508、57.如項目54至56中任一項所述的分離的胰腺β細胞的群體，其中所述群體包含比以表達胰高血糖素為特征的單激素胰腺α細胞多至少2倍的單激素β細胞，例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

509、58.如項目54或55所述的分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，其中所述群體是包含胰腺祖細胞的群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1為特征的胰腺祖細胞。

510、59.如項目54或55所述的分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，其中所述群體是包含內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如內分泌祖細胞，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

511、60.如項目59所述的分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，其中總細胞的至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％是內分泌祖細胞，例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

512、61.如項目54至60中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在療法中使用。

513、62.如項目54至61中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病，例如1型或2型糖尿病中使用。

514、63.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在療法中的治療中使用，其中所述細胞的群體已通過根據如項目1-53中任一項所述的方法生成。

515、64.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病，例如1型或2型糖尿病中使用，其中所述細胞的群體已通過根據如項目1-53中任一項所述的方法生成。

516、65.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在療法中的治療中使用，其中所述使用包括以下步驟：根據如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞；以及

517、向患者施用治療有效量的所述細胞。

518、66.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于在治療、預防和/或改善糖尿病，例如1型或2型糖尿病中使用，其中所述使用包括以下步驟：根據如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺β細胞的細胞或胰腺β細胞譜系細胞；以及

519、向患者施用治療有效量的所述細胞。

520、67.一種分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于如項目61至66中任一項所述使用，其中所述使用包括將所述群體移植到有需要的患者體內。

521、68.一種分離的胰腺β細胞的群體，用于如項目67所述的使用，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是單激素胰腺β細胞并且所述使用包括將單激素胰腺β細胞移植到有需要的患者體內。

522、69.一種分離的胰腺β細胞譜系細胞的群體，用于如項目67所述使用，其中所述胰腺β細胞譜系細胞是內分泌祖細胞并且所述使用包括將內分泌祖細胞移植到有需要的患者體內。

523、70.一種藥物組合物，其包含如項目54至69中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體，以及至少一種藥學上可接受的賦形劑或載劑。

524、71.一種成套試劑盒，其包含如項目54至60中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體、用于如項目61-69中任一項所述使用的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體、或如項目70所述的藥物組合物、以及合適的負載基底。

525、72.如項目71所述的成套試劑盒，其中所述合適的負載基底是如項目12-15中任一項所定義的2d基底，并且其中所述胰腺β細胞譜系細胞是內分泌祖細胞。

526、73.如項目71所述的成套試劑盒，其中所述合適的負載基底是3d基底并且其中所述細胞是單激素β細胞。

527、74.如項目53至59中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體在藥物篩選，例如體外藥物篩選中的用途。

528、75.一種體外藥物篩選的方法，該方法包括以下步驟：根據如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺內分泌譜系細胞，例如胰腺β細胞譜系細胞；以及

529、將所述細胞暴露于至少一種候選藥物化合物。

530、76.一種治療有需要的患者的方法，該方法包括向所述患者施用治療有效量的如項目54至60中任一項所述的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。

531、77.一種治療有需要的患者的方法，該方法包括以下步驟：根據如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺內分泌譜系細胞，例如胰腺β細胞譜系細胞；以及

532、向所述患者施用治療有效量的所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。

533、78.一種在有需要的患者中治療糖尿病的方法，該方法包括向所述患者施用治療有效量的如項目54至60中任一項所述的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。

534、79.一種治療有需要的患者的方法，該方法包括以下步驟：根據如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺內分泌譜系細胞，例如胰腺β細胞譜系細胞；以及

535、向所述患者施用治療有效量的所述胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。

536、80.如項目78或79所述的在有需要的患者中治療糖尿病的方法，其中所述患者患有1型或2型糖尿病。

537、81.如項目76至80中任一項所述的在有需要的患者中治療糖尿病的方法，其中所述施用包括將所述細胞移植到所述患者中。

538、82.如項目54至62中任一項所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體用于制造藥物的用途，該藥物用于在有需要的患者中治療糖尿病。

539、83.如項目82所述的分離的胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞的群體的用途，其中所述藥物的所述制造包括通過如項目1-53中任一項所述的方法生成胰腺β細胞或胰腺β細胞譜系細胞。

540、84.一種用于生成胰腺祖細胞的方法；其包括以下步驟

541、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

542、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；以及

543、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞。

544、85.一種用于生成內分泌祖細胞的方法；

545、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

546、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；

547、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞；

548、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體；

549、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

550、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞。

551、86.一種用于生成單激素β細胞的方法，

552、a)提供后前腸細胞的細胞群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞；

553、b)在允許分化為胰腺祖細胞的條件下培養所述后前腸細胞的細胞群體不超過大約78小時；

554、c)從而生成胰腺祖細胞的細胞群體，這些胰腺祖細胞是例如以表達pdx1和nkx6.1兩者為特征的胰腺祖細胞；

555、a+1)提供胰腺祖細胞的細胞群體；

556、b+1)在允許分化為內分泌祖細胞的條件下培養所述胰腺祖細胞的細胞群體；以及

557、c+1)從而生成內分泌祖細胞的群體，這些內分泌祖細胞是例如以表達nkx6.1和neurod1為特征的內分泌祖細胞；

558、a+2)將所述內分泌祖細胞的群體從2d基底上的培養轉移至3d培養條件；

559、b+2)在允許分化為胰腺單激素β細胞的條件下培養所述內分泌祖細胞的群體；以及

560、c+2)從而生成單激素β細胞的群體，這些單激素β細胞是例如以表達胰島素為特征的單激素β細胞。

561、87.如項目84所述的用于生成胰腺祖細胞的方法、如項目85所述的用于生成內分泌祖細胞的方法或如項目86所述的用于生成單激素β細胞的方法，在步驟a)-c)之前，還包括以下的步驟a-1)–c-1)：

562、a-1)提供原始腸管細胞的細胞群體，這些原始腸管細胞是例如以表達hnf1β和hnf4α為特征的原始腸管細胞；

563、b-1)在允許分化為后前腸細胞的條件下培養所述原始腸管細胞的細胞群體不超過大約54小時；以及

564、c-1)從而生成后前腸細胞的群體，這些后前腸細胞是例如以表達pdx1為特征的后前腸細胞。

565、88.如項目84或87所述的用于生成胰腺祖細胞的方法，其中所述方法如項目1-25中任一項所定義。

566、89.如項目85或87所述的用于生成內分泌祖細胞的方法，其中所述方法如項目1-36中任一項所定義。

567、90.如項目86或87所述的用于生成單激素β細胞的方法，其中所述方法如項目1-53中任一項所定義。