本發明屬于功能高分子材料制備，具體涉及一種多肽固相合成載體及其制備方法。

背景技術：

1、隨著組合化學的快速發展，聚合物載體在有機合成中得到越來越廣泛的應用。特別是在多肽合成和核酸合成領域，如固相合成方法的出現加快了多肽的合成速度，目前已應用于多個藥物的生產。多肽固相合成的基本過程如下：在不溶性的載體上引入氨基或羥基等功能基團，通過這些基團與α-氨基保護的氨基酸的羧基反應，將氨基酸以共價鍵的形式連接到載體上。然后將α-氨基保護基團脫除，洗滌干凈后加入下一個氨基被保護的氨基酸單體。重復上述步驟，直到合成所需要的多肽序列。因其突出的優點：可用過量的反應試劑使反應完全；每步的產物都固定于不溶于任何溶劑的固相載體上，所需產物與其他過量試劑、催化劑等小分子試劑可通過簡單過濾實現分離；在將產物與固相載體分離前的所有操作步驟中，固相載體始終處于同一容器中，沒有任何機械損失；易實現自動化。

2、固相合成載體的性能是成功實現固相合成的關鍵因素之一，為在合成過程中擁有較大空間來容納不斷增長的較長的肽鏈，也為使反應試劑易擴散到反應位點，所使用的載體需要有較好的溶脹性，現有技術中載體一般采用交聯度低，約1％～2％的聚苯乙烯凝膠載體，其在二氯甲烷、二甲基甲酰胺等溶劑中具有很高的溶脹度。制備低交聯的聚苯乙烯凝膠載體時使用的交聯劑為二乙烯基苯，但二乙烯基苯分子較小，形成的交聯橋會較短，進而使得交聯網絡伸展性差；且二乙烯基苯是剛性結構，這會使所合成的載體整體柔性變差，經多次溶脹后載體的機械強度會變差，出現破碎的情況，造成多肽合成設備的篩板堵塞。現有技術中還公開一種使用雙甲基丙烯酸二乙二醇酯或雙甲基丙烯酸三乙二醇酯作為交聯劑，制備出新一種具有較高溶脹性能的固相合成載體的方法，所制成的載體具有較好的反應動力學性能，但使用的交聯劑中含有酯鍵，酯鍵在強酸強堿條件中不穩定，限制了其使用范圍。現有技術中還公開了一種多肽固相合成中的低交聯度微球載體，溶脹性優良，反應動力學性質良好，不易產生碎片；但其使用1,4-雙對乙烯芐氧基丁烷作為交聯劑，1,4-雙對乙烯芐氧基丁烷的結構中含有苯環，在氯甲基化過程中，苯環易發生副反應改變載體結構。

技術實現思路

1、因此，本發明要解決的技術問題在于克服現有技術中溶脹性優良的固相合成載體或機械強度差或不穩定等缺陷，從而提供一種多肽固相合成載體及其制備方法。

2、為此，本發明提供了如下技術方案。

3、本發明提供一種多肽固相合成載體的制備方法，包括如下步驟：s1：配制水相，水相的組成包括純化水，分散劑；s2：配制油相，油相的組成包括單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體和引發劑；所述交聯單體包括烯丙基醚、乙二醇二烯丙基醚、二乙二醇二乙烯基醚中的至少一種；s3：將油相加入水相中，聚合反應，得到基球；s4：向所述基球上引入氨基或羥基，得到多肽固相合成載體。

4、可選的，所述分散劑為水溶性高分子。

5、可選的，所述單乙烯基化合物為芳香族單乙烯基化合物。

6、可選的，所述功能單體指單體中既具有可進行自由基聚合的雙鍵，又含有鹵代基團或其他可通過反應轉化為羥基、氨基的基團。

7、可選的，所述引發劑為有機過氧化物或偶氮化合物。

8、可選的，所述分散劑包括聚乙烯醇、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、聚丙烯酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種。

9、可選的，所述單乙烯基化合物包括苯乙烯及其苯環取代衍生物，取代基為含有1至5個碳原子的烷基或烷氧基。

10、可選的，所述功能單體包括酰氧基苯乙烯及其衍生物，鹵烷基苯乙烯單體，4-乙烯基苯基酯單體中的至少一種。

11、可選的，所述功能單體包括4-乙酰氧基苯乙烯，苯甲酰氧基苯乙烯，4-(4-溴丁基)苯乙烯，對氯甲基苯乙烯，4-乙烯基苯甲酸甲酯，4-乙烯基苯乙酸乙酯。

12、可選的，所述引發劑包括過氧化苯甲酰、過氧化月桂酰、過氧化-2-乙基己酸叔丁酯、偶氮二異丁腈、偶氮二異戊腈、偶氮二異庚腈中的至少一種。

13、優選的，所述分散劑為聚乙烯醇。

14、優選的，所述單乙烯基化合物為苯乙烯。

15、優選的，所述功能單體為對氯甲基苯乙烯。

16、優選的，所述引發劑為過氧化苯甲酰。

17、優選的，油相和水相的質量比為1:3～1:20。

18、可選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，單乙烯基化合物占65％～99.5％。

19、可選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，交聯單體占0.5％～5％。

20、可選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，功能單體占0～30％。

21、優選的，所述油相中，引發劑重量為單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量的0.5％～5％。

22、優選的，所述水相中，分散劑重量為水相重量的0.2％～5％。

23、優選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，單乙烯基化合物占77％～99％。

24、優選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，交聯單體占1％～3％。

25、優選的，所述油相中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，功能單體占0％～20％。

26、可選的，當油相中，功能單體占單體重量百分比的0％時，在步驟s3后，步驟s4前，還包括向所述基球上引入鹵代基團或其他可通過反應轉化為羥基、氨基的基團的步驟。引入各基團的操作為本領域內的常規操作，以引入鹵代基團為例，典型非限定地，具體操作為：在配備有攪拌器和溫度計的1l反應器中加入30～80g?s3步驟中的到的基球，加入250～800ml二氯甲烷，開動攪拌；將反應器中的溫度降低至-10～0℃；向反應器中加入15～50g的氯甲醚，繼續攪拌；向反應器中加入1.5～10g的四氯化錫；保持反應器中的溫度在-5～5℃，反應2h后結束反應。將反應器中的溶液抽干，使用二氯甲烷洗滌3次(每次加入量為250～800ml)后，將載體放入45℃烘箱中干燥，得到氯甲基化修飾的基球。

27、可選的，所述步驟s3中，聚合反應的溫度為50～90℃，時間為6-24h。

28、優選的，所述步驟s3中，聚合反應的溫度為68～85℃，時間為8-16h。

29、本發明提供的多肽固相合成載體的制備方法，具體可包括：配制水相，在反應器中加入一定量的純化水，并加入重量百分比為水相重量的0.2％～5％的分散劑，溶解備用；控制油相和水相的質量比為1:3～1:20，配制油相，稱取單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體和引發劑，其中，以單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量計，單乙烯基化合物占65％～99.5％，交聯單體占0.5％～5％，功能單體占0％～30％，引發劑用量為單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體的總質量的0.5％～5％，混合均勻；將油相加入反應器中，開動攪拌并升溫至50～90℃，反應6～24h，反應結束后清洗，篩分出粒徑35～300μm的產物，干燥，得到基球。

30、本發明提供的多肽固相合成載體的制備方法中，通過鹵代基團或其他可通過反應轉化為羥基、氨基的基團，向所述基球上引入氨基或羥基的方法為常規方法。

31、以基球上含有的為鹵代基團為例，典型非限定地，向含有氯基的基球上引入羥基的方法具體為：在配備有冷凝器、攪拌器和溫度計的1l反應器中加入30～50g基球，300～500ml?n,n-二甲基甲酰胺，開動攪拌；然后加入15～100g對羥基苯甲醇，升溫至50～60℃反應12～16h；反應結束后冷卻至室溫，然后用n,n-二甲基甲酰胺洗滌2次，純化水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌3次并濾干，真空干燥，得到含有官能團基為羥基的固相合成載體。

32、以基球上含有的為鹵代基團為例，典型非限定地，向含有氯基的基球上引入氨基的方法具體為：在配備有冷凝器、攪拌器和溫度計的1l反應器中加入30～50g基球，300～500mln,n-二甲基甲酰胺，開動攪拌；然后加入10～100g鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽，升溫至90～95℃反應12～16h；反應結束后冷卻至室溫，用n,n-二甲基甲酰胺洗滌2次，純化水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌3次并濾干，放回反應器中；向反應器中加入100～200g的無水乙醇和20～50g的水合肼，升溫至65～75℃反應12～16h；反應結束后用體積比為50:50的乙醇/純化水溶液洗滌3次，純化水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌3次并濾干，放回反應器中；向反應器中加入100～200g的無水乙醇和30～50g的濃鹽酸，升溫至50～60℃反應4～6h；反應結束后冷卻至室溫，水洗至中性，然后真空干燥，得到含有官能團基為氨基的固相合成載體。

33、本發明還提供一種上述制備方法制得的多肽固相合成載體。

34、可選的，所述多肽固相合成載體的粒徑為35-300μm。優選的，所述多肽固相合成載體的粒徑為75-150μm。這樣在設備中，載體不會因粒度太小造成篩板的堵塞，也保證了反應時試劑擴散的速度。

35、本發明提供的多肽固相合成載體，在用于制備多肽時，其方法為領域內常規的，典型非限定性地，具體步驟為(以含有官能團為羥基的固相載體——wang固相合成載體為例)：

36、(1)首位氨基酸的偶聯

37、向反應器中加入適量的固相合成載體，按照每克載體8～15ml的量加入二氯甲烷或n,n-二甲基甲酰胺溶脹30min，然后將溶液濾干；在燒杯中稱取fmoc保護氨基酸(1.5～2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)，1-羥基苯并三唑(hobt，1.5～2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)，加入適量的n,n-二甲基甲酰胺溶液攪拌溶解，然后向燒杯中加入n,n'-二異丙基碳二酰亞胺(dic，1.5～2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)和4-二甲氨基吡啶(dmap，0.1-0.3倍，以固相合成載體的物質的量計)混合均勻；將混合均勻的反應液加入反應器中，在室溫下反應2～3h；反應結束后將用溶液濾干，依次用n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)，二氯甲烷(每克載體8～15ml的量)，n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)洗滌三次，每次時間為30min，洗滌后濾干。

38、(2)fmoc保護基團的脫除

39、向反應器中加入20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液(v/v，每克載體8～15ml的量)，在室溫條件下反應30-60min；反應結束后將用溶液濾干，固相合成載體依次用n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)，二氯甲烷(每克載體8～15ml的量)，n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)洗滌三次，每次時間為30min，洗滌后濾干。

40、(3)氨基酸的偶聯

41、在燒杯中稱取fmoc保護氨基酸(1.5～2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)，hobt(1.5-2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)，加入適量的n,n-二甲基甲酰胺溶液攪拌溶解，然后向燒杯中加入dic(1.5-2.5倍，以固相合成載體的物質的量計)，混合均勻；將混合均勻的反應液加入反應器中，在室溫下反應2-3h；反應結束后將用溶液濾干，固相合成載體依次用n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)，二氯甲烷(每克載體8～15ml的量)，n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)洗滌三次，每次時間為30min，洗滌后濾干。

42、(4)fmoc保護基團的脫除

43、向反應器中加入20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液(v/v，每克載體8～15ml的量)，在室溫條件下反應30-60min；反應結束后將用溶液濾干，固相合成載體依次用n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)，二氯甲烷(每克載體8～15ml的量)，n,n-二甲基甲酰胺(每克載體8～15ml的量)洗滌三次，每次時間為30min，洗滌后濾干。

44、(5)肽鏈的延長

45、重復步驟(3)和步驟(4)，直至得到目標多肽；將負載多肽的固相合成載體用甲醇(每克載體8～15ml的量)洗滌三次，每次30min，洗滌后濾干，將載體放置到真空烘箱中干燥16-24h。

46、(6)裂解

47、稱取干燥的負載多肽的固相合成載體至反應器中，加入切割試劑(每克載體10～20ml的量)，切割試劑為三氟乙酸：苯甲硫醚：水＝95:2.5:2.5(v/v/v)，在室溫下反應2～4h，將多肽從固相合成載體上切割下來，過濾，收集濾液，再用三氟乙酸(每克載體10～20ml的量)洗滌載體兩次，收集并合并濾液得到溶液有多肽的切割液。

48、(7)沉淀

49、向溶液有多肽的切割液中加入冰乙醚(每毫升切割液加入8-10毫升冰乙醚)。在0～4℃條件下放置12～18h沉淀多肽，得到多肽粗品。

50、本發明的有益效果有：

51、本發明提供一種多肽固相合成載體的制備方法，包括如下步驟：s1：配制水相，水相的組成包括純化水，分散劑；s2：配制油相，油相的組成包括單乙烯基化合物、交聯單體、功能單體和引發劑；所述交聯單體包括烯丙基醚、乙二醇二烯丙基醚、二乙二醇二乙烯基醚中的至少一種；s3：將油相加入水相中，聚合反應，得到基球；s4：向所述基球上引入氨基或羥基，得到多肽固相合成載體。所制得的多肽固相合成載體同時擁有溶脹高和機械強度好的性能，在使反應試劑易擴散的同時，提高了其使用壽命，降低了成本。使用烯丙基醚、乙二醇二烯丙基醚、二乙二醇二乙烯基醚中的至少一種作為交聯劑，它們的分子鏈較長，且具有一定的親水性，能夠提高多肽固相合成載體的溶脹性能，有利于反應試劑的擴散，提高反應效率；結構穩定，在載體進行官能化過程或合成多肽過程中不會發生副反應，導致載體微結構發生變化或者引入雜質；聚合速度較慢，有利于提高載體內部化學結構的均勻性，形成均勻分布的活性位點；活性位點均勻分布避免了多肽合成過程中多肽鏈的相互影響，導致載體破碎情況的發生，提高了載體的機械強度。

52、本發明提供的多肽固相合成載體的制備方法中，規定油相和水相的質量比為1:3～1:20，可以減少制備過程中載體之間的粘結，提高聚合熱的傳導，同時提高設備利用率，進而提高生產效率。