本發明涉及生物制藥，尤其是涉及含有質粒的大腸桿菌的發酵方法和生產質粒的方法。

背景技術：

1、質粒發酵是將生產質粒的菌種接種于合適的培養體系中，在適宜的培養體系中，使菌種大量復制，同時在細菌細胞內大量快速合成質粒dna的技術。或者也可以說是質粒擴增，其是大量獲取質粒的一種化學生物學方法，通常包括將細菌質粒轉化到大腸桿菌中，然后從大腸桿菌中收獲大量質粒的過程。

2、現有技術中對連續生產質粒也進行了一些探索。例如us2008/0318283a1中探索了兩級發酵和連續補料放料的方式，其中第一階段發酵的溫度為30℃，第二階段發酵溫度為36-45℃。但其發酵過程和收獲菌液一直連續不間斷，每小時才收獲0.32l的菌液。其中的缺陷在于，其一，該種連續發酵，會造成部分剛從一級罐進入二級罐的菌液未經溫度充分誘導，質粒產量較低的情況下，就作為質粒產物收獲。其二，該種連續發酵，會造成部分剛進入二級罐的補料培養基和來自一級罐的菌液，其營養物質未消耗完就作為質粒產物收獲，物料利用率較低，成本浪費。其三，該種連續發酵連續收獲質粒菌液，通過離心或中空纖維等方式連續收獲菌體較為困難，需要第三個儲存罐暫時儲存菌液，到達一定體積后再去通過離心或中空纖維等方式收獲菌體，但同時這部分細菌在儲存罐中仍會生長，尤其是較早收獲的菌液在儲存罐時間較長，若要維持較低的生長代謝，最好降溫以至15℃以下，放到生產規模，成本極其高昂。其四，其二級罐補料培養基從一級罐菌液進入二級罐同時即開始補加補料培養基，補料方式為連續補料，此時菌液od600較低，營養物質十分充足，可能會導致二級罐內營養物質過剩，碳氮比失衡，不利于菌液生長。

3、目前質粒發酵平臺經歷了兩代工藝的迭代，第一代質粒發酵工藝相對粗放，將菌種初步復蘇培養獲得細菌種子，接種至發酵罐中，經過18-22h的發酵，待培養基中營養物質耗完后，結束發酵，收獲菌體，發酵類型屬于批次發酵工藝，隨著發酵進行，培養基中的代謝廢物也在緩慢增加，并且菌體生長和質粒生產時機并不完全匹配，在結束發酵時，營養物質耗盡，但菌體生產質粒并未達到頂點。

4、因此，有必要研究開發更高效的質粒發酵或質粒生產方法。

技術實現思路

1、基于上述缺陷和考慮開發第二代發酵工藝，該工藝為批次補料發酵工藝，在批次發酵的基礎上，發酵后期，營養物質消耗結束時，通過流加補料，增加培養基中營養物質，延長質粒生產時間，達到高產質粒的目的。兩種發酵工藝質粒產量對比如圖1所示，批次補料發酵工藝相較于批次發酵，質粒產量可以由補料前的約550mg/l提高至770mg/l，同時也由于補料的加入，發酵體積也會增加，最終產量可以提高50％以上。但是，現有的批次補料發酵工藝在質粒生產過程中，整個生產周期約為3.5天，但在發酵罐上的時間僅為28小時，大量的時間用在種子培養和前期準備和后處理中，生產質粒效率比較低，因此考慮如何延長在發酵罐的生長時間，則在整個發酵周期內，種子培養和前期及后處理的占比時間會大大縮短，可以節省大量發酵時間成本，可以達到以相同時間來高產質粒的目的。此外，充分考慮并克服現有連續發酵的缺陷。

2、有鑒于此，特提出本發明。

3、本發明提供一種含有質粒的大腸桿菌的發酵方法，其是兩級發酵，

4、s1一級罐發酵，采用恒溫發酵30-34℃發酵，維持od為20-40；

5、s2二級罐發酵，將一級罐中的發酵液轉移到二級罐中，進行升溫發酵，溫度恒溫在37℃至42℃。且所述s2中，采用補料發酵的方式進行培養，補料時機為c源耗完，do急速回升大于70％進行補料方式。

6、s1和s2采用發酵培養基為發酵基礎培養基，其包含有磷酸氫二鉀三水合物、磷酸二氫鉀、酵母浸出粉、甘油、消泡劑、硫酸卡那霉素和七水硫酸鎂的液體培養基；

7、優選地，其配方如下：磷酸氫二鉀三水合物6.55g/l；磷酸二氫鉀3.5g/l；酵母浸出粉80.0g/l；甘油60.0g/l；消泡劑0.05％(v/v)；硫酸卡那霉素0.05g/l；七水硫酸鎂0.50g/l。

8、所述s1中，一級罐留種比例為0.5％-1％，并補充與轉移到二級罐中的發酵液相等體積的新鮮發酵培養基進行連續培養。

9、所述s1中，培養溫度最優為31-33℃，更優為32℃；維持od為25-35，更優維持od為28-32，最優維持od為30。

10、所述s2中，采用do反饋補料，具體地補料體積35-45ml/次，補料時間3-5h，進行2-5個循環的連續發酵，優選地補料體積40ml/次，補料時間4h，進行3-4個循環的連續發酵。

11、所述補料培養基含有甘油、酵母粉、七水硫酸鎂、微量元素母液；其中微量元素母液、含有七水硫酸亞鐵、二水氯化鈣、四水氯化錳、七水硫酸鋅、六水氯化鈷、二水氯化銅、四水鉬酸銨、十水硼酸鈉和濃鹽酸；

12、或者所述補料培養基配方如下：含有甘油、酵母粉、七水硫酸鎂、維生素溶液母液；其中維生素溶液母液含有鹽酸硫胺(vb1)、生物素、煙酰胺、維生素b12、d-泛酸鈣(vb5)和吡哆辛鹽酸鹽(vb6)。

13、優選地，所述補料培養基配方如下：甘油300g/l；酵母粉250g/l；七水硫酸鎂1g/l；微量元素母液10ml/l；其中微量元素母液按1000ml計，含有七水硫酸亞鐵6.95g；二水氯化鈣

14、1.47g；四水氯化錳9.90g；七水硫酸鋅2.88g；六水氯化鈷0.357g；二水氯化銅0.256g；四水鉬酸銨1.85g；十水硼酸鈉3.05g；濃鹽酸25ml。

15、或者所述補料培養基配方如下：甘油300g/l；酵母粉250g/l；七水硫酸鎂1g/l；維生素溶液母液10ml/l；其中維生素溶液母液按1000ml計，鹽酸硫胺(vb1)4g/l；生物素0.20g/l；煙酰胺(vb3)4g/l；維生素b124g/l；d-泛酸鈣(vb5)2g/l；吡哆辛鹽酸鹽(vb6)4g/l。

16、所述s2中，培養溫度最優為39-41℃，更優為40℃。

17、所述大腸桿菌可以任何類型的大腸桿菌是野生型大腸桿菌或其衍生的大腸桿菌如突變的大腸桿菌，例如dh5α、dh10b、bl21、jm109、jm110、top10、hb101、xl0-gold、m110、scs10等系列大腸桿菌。

18、質粒可以是任何適合于大腸桿菌的質粒，例如puc系列質粒如puc19，plyss，prare，pgex系列載體如pgex-1λt、pgex-2t、pgex-3t，pet系列載體如pet-28a-c(+)、ppl系列載體如ppl-lamda，pezz18、pinii系列載體如pinii-ompa1、pinii-coma1、pinii-coma2、pinii-coma3，pkk223系列載體如pkk223-3，pvax1等，以及穿梭載體如pyes2/nt/lacz等。

19、本發明還提供一種生產質粒的方法，其是通過上述方法發酵獲得含有質粒的大腸桿菌的步驟，以及從中收集所述質粒的步驟。

20、本發明通過大量的研究探索最終形成了適合于大腸桿菌質粒生產的二級發酵工藝。具體來說，本發明經過恒溫發酵和兩級發酵的條件摸索，包括溫度，維持od，升溫od，補料成分，放料補料方式，留種比例等參數摸索，發現采用兩級發酵的方式可以較好的達到連續發酵的目的，可以連續發酵至少50h以上，二級罐可以連續生產至少4個循環，同時質粒質量沒有明顯變化。在一個發酵周期內，單位時間質粒產量至少提高300％以上，提升效果明顯。雖然使用兩個設備，但是二級罐上生產周期為11h左右，大大縮短了質粒高效生產的周期，且連續循環還可繼續進行，后續產量數據優勢會更加明顯；同時延長了一級發酵罐的生長時間，在整個發酵周期內，種子培養和前期及后處理的占比時間會大大縮短，可以節省大量發酵時間成本，可以達到以相同時間來高產質粒的目的。尤其是在本發明實施例中也證實了，間歇放料和補料對菌體的活力維持更加有利，可能與間歇放料補料后，罐內的代謝廢物的比例會低于連續發酵，同時加入的營養物質含量會高于連續放料補料，維持更低的od水平(60-80)也會有利于菌體活力水平有關。