本發(fā)明屬于生物，涉及細胞生物學，具體涉及金納米顆粒在貝類血細胞轉染中的應用。

背景技術：

1、轉染細胞的手段主要分為三大類：生物轉染（利用慢病毒、腺病毒等工程化病毒載體將遺傳物質導入受體細胞中）、化學轉染（通過脂質體、陽離子聚合物等與細胞膜相互作用而胞吞進入胞內）、物理轉染（基于電轉染、顯微注射等操作機械性改變局部細胞膜的物理性質將遺傳物質注入細胞內部）。

2、對于貝類細胞而言，盡管生物轉染的難度較低，但病毒載體的使用會使得貝類細胞存在一定的細胞毒素隱患，鑒于貝類的主要食用價值，因此生物轉染在貝類細胞中的應用十分有限。相比之下，物理轉染和化學轉染方法具有較高的優(yōu)先級。其中，顯微注射作為一種經(jīng)典的遞送手段，首先在貝類細胞中嘗試，由于雙殼貝類細胞直徑微小，遠小于小鼠等脊椎動物，對技術和設備要求較高，且受精卵數(shù)量龐大，自然死亡率較高，基于顯微注射的低通量手段難以應用。另外，電轉染和脂質體法也被嘗試應用在貝類的轉染操作中，電轉法利用電脈沖可以高通量處理大量細胞，因而應用十分廣泛，但不同類型的細胞膜差異性較大，具體電轉參數(shù)有所不同，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明貝類細胞電轉后細胞存活率極低，其中，對牡蠣細胞電轉的結果最高僅有9?%的存活率。而脂質體遞送作為一種較新的轉染方式也應用于貝類細胞，但其轉染效率偏低，仍然很難滿足貝類細胞的遞送需要，其中，在蝦夷扇貝中轉染效率最高僅為13.2?%。因此，當下的貝類轉染方法因細胞存活率較低，且因轉染操作的不同形式普遍導致貝類細胞的死亡率一直居高不下，大大限制了貝類遺傳等工作的深度開展，對于貝類細胞而言，亟需一種對細胞損傷程度小且轉染效率較高的轉染方法。

3、伴隨著材料學的研究，納米技術逐漸應用于生物學當中，金納米顆粒（goldnanoparticles,?aunps）是一類主要由金元素（au）組成的納米級別的材料。該顆粒大小通常在1-100納米之間，可為球狀、棒狀、多面體等，通過調整大小及形狀可以改變其光學及催化活性。金元素賦予其良好的化學穩(wěn)定性和較優(yōu)的生物相容性，這使得金納米顆粒不易發(fā)生氧化等化學反應，同時具備與蛋白質、核酸等生物分子相互作用的能力。通過對顆粒表面進行修飾以改善其功能，如硫醇類物質、抗體等，可減少顆粒聚集現(xiàn)象并提高其穩(wěn)定性和靶向效果。

4、金納米顆粒的這些優(yōu)良特性使其應用十分廣泛，在生物成像、靶向藥物遞送、癌癥治療、生化傳感器和光學材料等領域具有廣泛的應用前景。目前，該技術在哺乳動物細胞、酵母、大腸桿菌和干細胞等細胞類型中均成功應用，但在水生動物細胞中未見報道。尤其是海洋無脊椎動物，生境復雜，細胞培養(yǎng)和轉染存在挑戰(zhàn)。其中，貝類作為海洋無脊椎動物中的最大類群，尚無穩(wěn)定細胞系的建立。因其血細胞具有數(shù)量多、易獲得、易操作等優(yōu)點，在貝類基因操控研究中被廣泛使用。因此，亟需在貝類血細胞中驗證金納米轉染技術的可行性，并對其粒徑尺寸、工作濃度及孵育時間等參數(shù)開展系統(tǒng)性研究，優(yōu)化轉染條件以實現(xiàn)貝類血細胞高效轉染方法的建立。該方法的實施，將對實現(xiàn)貝類細胞的遺傳操控、解決貝類發(fā)育進化等重大生物學難題提供重要技術支撐，也將為水生動物細胞的高效無損轉染技術開發(fā)提供一份可參考的模版。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了金納米顆粒在貝類血細胞轉染中的應用以及高效轉染貝類血細胞的方法。

2、本發(fā)明的技術方案主要包括以下內容：

3、本發(fā)明提供了金納米顆粒在貝類血細胞轉染中的應用。即，使用金納米材料作為載體，將生物分子遞送至貝類血細胞中，從而達到提高轉染效率和維持血細胞高存活率的目的。

4、進一步的，本發(fā)明還提供一種金納米顆粒介導的高效轉染貝類血細胞的方法，包括以下步驟：

5、s1：制備負載生物分子的金納米材料；所述生物分子包括dna，所述dna的核苷酸序列為seq?id?no:1~seq?id?no:4中的任意一種；

6、s2：制備貝類血細胞懸液；

7、s3：貝類血細胞轉染：將負載dna的金納米材料與血細胞懸液混合，共孵育。

8、優(yōu)選的，步驟s1為：

9、制備負載生物分子的金納米材料：在水中加入單寧酸、二水合檸檬酸鈉和?碳酸鉀，加熱，加入氯金酸后繼續(xù)加熱，得aunps；在nano3存在下，將生物分子與aunps混合，得混合液a，向混合液a中加入正丁醇并快速渦旋混合，得混合液b，隨后向混合液b中加入tbe緩沖液并快速渦旋混合，最后，通過離心分離兩相溶液，得下層負載生物分子的金納米材料，保存?zhèn)溆茫凰錾锓肿影╠na，所述dna的核苷酸序列為seq?id?no:1~seq?id?no:4中的任意一種；

10、優(yōu)選的，步驟s3中，負載dna的金納米材料與血細胞懸液混合后，負載dna的金納米材料的終濃度為5~10nm；共孵育時間為3~9小時。

11、優(yōu)選的，步驟s1為：

12、制備負載生物分子的金納米材料：在138.2?ml?超純水中加入0.1?ml?2.5?mm?單寧酸、9.7?ml?1?wt%二水合檸檬酸鈉溶液和1?ml?150?mm?碳酸鉀溶液加熱到68?℃，加入1ml?1wt%?氯金酸后68?℃加熱15?min，得aunps；在50?μl超純水中加入30?μl?250?nmaunps、15?μl?100?μm?生物分子和5?μl?200?mm?硝酸鈉并混合均勻，得混合液a，向混合液a中加入正丁醇并快速渦旋混合，得混合液b，隨后，向混合液b中加入0.5×tbe緩沖液并快速渦旋混合，最后，通過離心分離兩相溶液，得下層負載生物分子的金納米材料，保存?zhèn)溆茫凰錾锓肿影╠na，所述dna的核苷酸序列為seq?id?no:1~seq?id?no:4中的任意一種。

13、優(yōu)選的，所述正丁醇和所述混合液a的體積比為7:1。

14、優(yōu)選的，所述0.5×tbe緩沖液與所述混合液b的體積比為1:4。

15、優(yōu)選的，所述dna的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

16、優(yōu)選的，步驟s2中，血細胞懸液中的細胞濃度為1×106~2×106個/ml。

17、優(yōu)選的，步驟s3中，共孵育的溫度是18~20℃，共孵育時間為6h。

18、優(yōu)選的，所述貝類包括蝦夷扇貝。

19、本發(fā)明的有益效果：

20、本發(fā)明使用金納米材料作為載體攜帶生物分子進入細胞，作為一種高通量的轉染方法比常用的遞送方法（如脂質體法和電穿孔法）有著更低的毒性，同時具有更高的轉染效率。在已有的報道中，常用的商業(yè)化脂質體對扇貝細胞的轉染率僅為13.2?%，電轉染的效率更是低于5?%，而基于本發(fā)明的轉染方法對貝類細胞的轉染效率可達48.3?%，存活率高達74.9?%。

21、本發(fā)明通過將金納米材料與貝類血細胞進行共孵育培養(yǎng)，使金納米材料通過細胞的胞吞作用進入細胞內部，將其攜帶的生物分子遞送進入細胞中。該方法利用低細胞傷害性的金納米材料作為載體攜帶生物分子進入細胞，提高了細胞存活率和轉染效率，簡化了操作程序。