本發(fā)明屬于生物制藥，具體地，本發(fā)明涉及一種抗her2單域抗體的免疫毒素分子、及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、表皮生長(zhǎng)因子受體2(human?epidermal?growth?factor?receptor?2，her2)是表皮生長(zhǎng)因子受體家族四成員之一，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中均有表達(dá)。

2、根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(iarc)近日發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，超過(guò)了肺癌的220萬(wàn)例，成為了全球第一大癌種。而在乳腺癌患者中，her2陽(yáng)性患者的比例達(dá)到20％～25％，其腫瘤生物學(xué)特征惡性程度高，轉(zhuǎn)移和死亡率更高。曲妥珠單抗、帕妥珠單抗以及兩種藥物的固定劑量組合制劑均顯著改善了her2陽(yáng)性乳腺癌的臨床治療獲益和生存期，但是這類患者的二線及以后治療，仍然面臨有效治療手段不足的困境。

3、抗體偶聯(lián)藥物(adcs)通過(guò)單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原結(jié)合，將細(xì)胞毒藥物定向遞送到腫瘤病灶，隨著小分子毒素被釋放，可以實(shí)現(xiàn)與dna小溝或微管蛋白結(jié)合等多種機(jī)制誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮藥物的細(xì)胞毒性，由此，也為her2陽(yáng)性乳腺癌患者提供了新的治療選擇。adc也被認(rèn)為是未來(lái)十年單克隆抗體藥物發(fā)展(特別是在腫瘤靶向治療領(lǐng)域)的重要方向之一。根據(jù)evaluate?pharma和bcg的預(yù)測(cè)，全球adc市場(chǎng)預(yù)計(jì)2024年將達(dá)到129億美元，2018至2024年的年復(fù)合增長(zhǎng)率約為35％。

4、當(dāng)前，全球商業(yè)化最成功的adc藥物是治療her2陽(yáng)性乳腺癌的kadcyla(恩美曲妥珠單抗，t-dm1)，該藥已是her2陽(yáng)性乳腺癌在國(guó)際上的二線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，2019年全球銷售額達(dá)到13.93億瑞士法郎。2019年5月，kadcyla還被fda批準(zhǔn)為her2陽(yáng)性早期乳腺癌患者(接受紫杉烷和曲妥珠單抗治療后仍殘留浸潤(rùn)性疾病)的輔助治療方案，市場(chǎng)空間進(jìn)一步擴(kuò)容。緊隨其后的是由第一三共和阿斯利康聯(lián)合開(kāi)發(fā)的enhertu(ds8201a)，這款adc于2019年12月被fda首次批準(zhǔn)用于治療her2陽(yáng)性乳腺癌，具有優(yōu)異的療效。

5、在過(guò)去的數(shù)年中，免疫偶聯(lián)物已被開(kāi)發(fā)為治療惡性腫瘤的備選治療方法。免疫偶聯(lián)物最初由抗體與植物或細(xì)菌毒素通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)組成，該免疫偶聯(lián)物為一種被稱為免疫毒素的形式。抗體與靶細(xì)胞上表達(dá)的抗原結(jié)合，并且毒素被內(nèi)化，從而通過(guò)阻止蛋白合成和誘導(dǎo)凋亡引起細(xì)胞死亡(brinkmann，u.，mol.med.today，2：439-446(1996))。最近，已經(jīng)將編碼抗體和毒素的基因融合，并將免疫毒素表達(dá)為融合蛋白。

6、已有很多研究在利用稱為假單胞菌外毒素a(“pe”)的細(xì)菌毒素作為毒性部分的免疫毒素上進(jìn)行。通常，將pe截短或突變，從而降低其非特異性毒性，但又不會(huì)破壞其對(duì)于被免疫毒素的靶向部分所靶向的細(xì)胞的毒性。目前，對(duì)利用基于pe的免疫毒素作為多種癌癥的治療手段的測(cè)試正進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

7、目前的基于pe的免疫毒素的免疫原性很強(qiáng)。經(jīng)證實(shí)，這一點(diǎn)在血液學(xué)惡性腫瘤的治療中不是問(wèn)題，因?yàn)樵谘簩W(xué)惡性腫瘤中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答的能力通常遭受破壞。通常可以將免疫毒素多次給予血液學(xué)惡性腫瘤患者。然而，實(shí)體瘤患者通常在首次給藥后的數(shù)周內(nèi)產(chǎn)生對(duì)基于pe的免疫毒素的中和抗體。因?yàn)楹芏喾桨敢笤诿庖叨舅亟o藥之間具有3周的時(shí)間，所以該時(shí)間段內(nèi)抗體的產(chǎn)生實(shí)際上意味著，對(duì)于實(shí)體瘤而言，在患者的抗體致使基于pe的免疫毒素失效之前，通常僅有3周時(shí)間窗口。盡管如此，基于pe的免疫毒素的單次給藥也能非常有助于減小患者的腫瘤負(fù)荷、消滅較小的轉(zhuǎn)移灶和緩解癥狀。但是，仍希望能擁有可降低患者的免疫原性應(yīng)答的抗原性較低形式的基于pe的免疫毒素。

8、目前，her2陽(yáng)性乳腺癌的二線及后期治療仍然面臨有效治療手段不足的困境，需要新的療法。因此仍然需要開(kāi)發(fā)新的抗her2單域抗體的免疫毒素分子、及其制備方法與應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種抗her2單域抗體的免疫毒素分子、及其制備方法與應(yīng)用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗her2的免疫毒素分子，從n端到c端包括如下分子式所示的融合多肽：

3、ab-l-pe；

4、其中，所述ab為抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段；

5、l為連接子；

6、pe包含如seq?id?no：4所示的氨基酸序列或者seq?id?no：4的變體；

7、其中，所述抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段包含抗her2的單域抗體，所述單域抗體包括以下三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)cdr：

8、seq?id?no.10所示的cdr1，

9、seq?id?no.11所示的cdr2，和

10、seq?id?no.12所示的cdr3；

11、在另一優(yōu)選例中，所述抗her2單域抗體包含如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；或包含與seq?id?no.2具有至少98％或99％以上同一性的氨基酸序列。

12、在另一優(yōu)選例中，所述l包含如seq?id?no：13所示的裂解位點(diǎn)。

13、在另一優(yōu)選例中，所述l包含(g4s)m或gs(g4s)m，m選自1～5的正整數(shù)。

14、在另一優(yōu)選例中，所述l的序列如seq?id?no.3所示。

15、在另一優(yōu)選例中，所述免疫毒素分子還包含

16、(i)任選的提升蛋白理化性質(zhì)或成藥性的功能域；和/或

17、(ii)任選的協(xié)助表達(dá)和/或純化的標(biāo)簽序列。

18、在另一優(yōu)選例中，所述提升蛋白理化性質(zhì)或成藥性包括延長(zhǎng)抗her2單域抗體的半衰期。

19、在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽序列選自下組：6his標(biāo)簽、gggs序列、flag標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽。

20、在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽序列如seq?id?no.5所示。

21、在另一優(yōu)選例中，所述抗her2的免疫毒素分子包含如seq?id?no.1或6所述的氨基酸序列；或包含與seq?id?no.1或6具有至少98％或99％以上同一性的氨基酸序列。

22、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的抗her2的免疫毒素分子。

23、在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含如seq?id?no:7所示的核苷酸序列。

24、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含如本發(fā)明的第二方面所述的核酸分子。

25、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如本發(fā)明的第三方面所述的表達(dá)載體。

26、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種如本發(fā)明的第一方面所述的抗her2的免疫毒素分子的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

27、a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)抗her2的免疫毒素分子；

28、b)分離并純化步驟a)所述的抗her2的免疫毒素分子。

29、在另一優(yōu)選實(shí)施例中，在純化過(guò)程中采用如seq?id?no.9所示ulp1his酶對(duì)帶有sumo標(biāo)簽的免疫毒素分子進(jìn)行酶切，從而切除sumo標(biāo)簽。

30、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的如本發(fā)明的第一方面所述的抗her2的免疫毒素分子和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。

31、在本發(fā)明的第七方面，提供了如本發(fā)明的第一方面所述的抗her2的免疫毒素分子、第六方面所述的藥物組合物在制備治療her2陽(yáng)性表達(dá)的癌癥的藥物中的應(yīng)用。

32、在本發(fā)明的第八方面，提供了如本發(fā)明的第七方面所述的應(yīng)用，所述癌癥選自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌和非小細(xì)胞肺癌。

33、在本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療her2陽(yáng)性表達(dá)的癌癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用如本發(fā)明的第一方面所述的抗her2的免疫毒素分子或本發(fā)明的第六方面所的藥物組合物。

34、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥選自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌或非小細(xì)胞肺癌中的任一種或多種。

35、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。