本發明屬于細胞培養領域，具體涉及一種從誘導性多能干細胞(ipsc)誘導分化自然殺傷細胞(nk細胞)的方法，更具體地，本發明涉及一種使用刺激物組合從人ipsc定向誘導分化人nk細胞的方法。

背景技術：

1、nk細胞是天然免疫系統的核心細胞，是機體對抗腫瘤和病毒感染的第一道免疫防線，同時參與機體免疫調節功能。有別于適應性免疫系統的特異性殺傷，nk細胞不針對任何特異性腫瘤標志物，而是通過腫瘤共有的一些特征進行識別，如主要組織相容性復合體(mhc-i)受體下調和表達損傷相關蛋白，因此nk細胞開發出的細胞治療藥物具有廣譜適應性。識別到腫瘤細胞后，無需免疫系統指令，也無需其它免疫細胞配合，nk細胞可以第一時間獨立迅速的進行直接殺傷。

2、已開展的臨床研究中，nk細胞在血液瘤的臨床應用最多，多個針對急性髓系白血病的臨床研究都觀察到了明確的臨床效果，總體反應率能達到50％以上，有部分患者可達完全緩解(complete?response，cr)(cliona?m.rooney,can?treg?elimination?enhancenk?cell?therapy?for?aml？blood[j]2014,volume?123:3848-3849；romee?etal.cytokine-induced?memory-like?natural?killer?cells?exhibit?enhancedresponses?against?myeloid?leukemia.sci.transl.med.[j]2016,8(357):357ra123)。其它血液腫瘤，如多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤，以及部分實體瘤也觀察到不錯的臨床效果，更重要的是，nk療法的安全性高，幾乎沒有觀測到任何移植物抗宿主反應(gvhd)和相關毒性。

3、基于以上優點，多種來源的nk細胞已被應用于腫瘤的免疫治療，包括自體來源，異體來源，細胞系來源，臍帶血來源和體外誘導的多能干細胞(ipsc)來源等等。

4、人類多能干細胞，特別是ipsc，可以有效分化為免疫細胞(如nk細胞)，被認為是產生免疫細胞的更好方法。ipsc誘導分化的nk細胞的受體和基因表達譜與從外周血或人臍血純化的nk細胞相似，而不會產生染色體異常的風險，具有同質性和不受供體變異影響的優點。同時，來源于ipsc的nk細胞可以適合癌癥免疫治療臨床研究的規模產生，而原代nk細胞較難分離、純化和基因修飾。此外，ipsc誘導分化的nk細胞相對容易使用病毒載體和crispr技術進行基因工程改造。

5、已有報道證實，人類ipsc誘導分化的nk細胞能有效殺傷血液系統惡性腫瘤，包括急性髓系白血病(aml)和多發性骨髓瘤，也可以有效殺傷白血病和卵巢癌細胞，而不會進一步產生畸胎瘤。2018年，li等人在cell?stem?cell(li?et?al.human?ipsc-derivednatural?killer?cells?engineered?with?chimeric?antigen?receptors?enhance?anti-tumor?activity.cell?stem?cell[j].2018,23(2):181-192.)報告了用car修飾ipsc衍生的nk細胞，以提高nk細胞對表達間皮素的腫瘤的殺傷活性，包括體外和體內。盡管安全性問題和臨床有效性有待解決，ipsc?car-nk細胞仍為car治療提供一個有吸引力的選擇。car-nk的car結構在car-t基礎上有所改進，更適合nk細胞激活，靶點也類似。

6、許多研究報告了從人類ipsc中誘導發育成熟的nk細胞。誘導方法包括cd34+造血干細胞前體細胞的產生和增殖，同時保留nk細胞分泌的細胞因子(il-15、il-3、il-7、scf和flt3配體)，以及使用表達膜結合il-21的細胞系作為飼養層細胞來促進其發育等，從而將nk細胞產量提高到臨床水平。

7、多家國內外公司已布局相關產品。2019年，fate?therapeutics公司的ipsc衍生nk細胞產品ft500和ipsc-car-nk產品ft596獲得fda的ind許可開展臨床試驗，安全性良好，截止2021年10月，26名患者中18名(69％)在單次劑量ft596后的第29天達到客觀緩解，12名患者(46％)達到完全緩解。該公司其它產品也取得良好進展。全球car-nk細胞療法的開發正在開展中。絕大多數car-nk細胞療法正處于臨床ⅰ期，占比約68％，處于ⅱ期的項目約32％，尚無car-nk細胞療法進入臨床ⅲ期。

8、因此，開發高質量的ipsc來源的nk細胞培養技術，市場空間廣闊，對于提高腫瘤的細胞治療效果至關重要。

技術實現思路

1、為了解決上述問題，在一個方面，本發明的目的是提供一種從ipsc(優選人ipsc)誘導分化nk細胞的方法，其包括

2、使ipsc依次在第一分化培養基、第二分化培養基、第三分化培養基、第四分化培養基和第五分化培養基中培養，

3、第一分化培養基補充有chir99021，

4、第二分化培養基補充有vegf和bfgf，

5、第三分化培養基補充有視黃酸(ra)，

6、第四分化培養基補充有il-3、il-7、il-15、scf和flt3配體，

7、第五分化培養基補充有il-7、il-15、scf和flt3配體。

8、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，第一分化培養基中的chir99021的終濃度為1-12μm；優選地，chir99021的終濃度為6μm。

9、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，第二分化培養基中的vegf的終濃度為50-500ng/ml，bfgf的終濃度為50-500ng/ml；優選地，vegf的終濃度為200ng/ml，bfgf的終濃度為400ng/ml。

10、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，第三分化培養基中的ra的終濃度為0.5-5μm；優選地，ra的終濃度為2μm。

11、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，第四分化培養基中的il-3的終濃度為5-50ng/ml，il-7的終濃度為5-50ng/ml，il-15的終濃度為5-50ng/ml，scf的終濃度為5-50ng/ml，flt3配體的終濃度為5-50ng/ml；優選地，il-3的終濃度為5ng/ml，il-7的終濃度為20ng/ml，il-15的終濃度為10ng/ml，scf的終濃度為20ng/ml，flt3配體的終濃度為10ng/ml。

12、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，第五分化培養基中的il-7的終濃度為5-50ng/ml，il-15的終濃度為5-50ng/ml，scf的終濃度為5-50ng/ml，flt3配體的終濃度為5-50ng/ml；優選地，il-7的終濃度為20ng/ml，il-15的終濃度為10ng/ml，scf的終濃度為20ng/ml，flt3配體的終濃度為10ng/ml。

13、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，ipsc的接種密度為2-4×105/ml。

14、在一些實施方式中，在本發明的上述方法中，將ipsc使用第一分化培養基培養1天，使用第二分化培養基培養3天，使用第三分化培養基培養3天，使用第四分化培養基培養7天，使用第五分化培養基培養21-46天。

15、本發明的方法包括以下具體步驟：在37℃、5％?co2和100％濕度條件下，將ipsc細胞置于24孔細胞培養板中，使用第一分化培養基培養1天，使用第二分化培養基培養3天，使用第三分化培養基培養3天，使用第四分化培養基培養7天，使用第五分化培養基培養21-46天，期間根據懸浮細胞生長情況轉移至6孔細胞培養板中，獲得誘導分化的nk細胞。

16、在另一個方面，本發明的目的是提供一種從ipsc誘導分化的nk細胞，其通過本發明的上述方法獲得。

17、在又另一個方面，本發明的目的是提供一種從ipsc誘導分化nk細胞的試劑盒，其包含分化基礎培養基、第一分化培養基、第二分化培養基、第三分化培養基、第四分化培養基和第五分化培養基，

18、第一分化培養基補充有chir99021，

19、第二分化培養基補充有vegf和bfgf，

20、第三分化培養基補充有ra，

21、第四分化培養基補充有il-3、il-7、il-15、scf和flt3配體，

22、第五分化培養基補充有il-7、il-15、scf和flt3配體。

23、在一些實施方式中，在本發明的上述試劑盒中，第一分化培養基中的chir99021的終濃度為1-12μm；優選地，chir99021的終濃度為6μm。

24、在一些實施方式中，在本發明的上述試劑盒中，第二分化培養基中的vegf的終濃度為50-500ng/ml，bfgf的終濃度為50-500ng/ml；優選地，vegf的終濃度為200ng/ml，bfgf的終濃度為400ng/ml。

25、在一些實施方式中，在本發明的上述試劑盒中，第三分化培養基中的ra的終濃度為0.5-5μm；優選地，ra的終濃度為2μm。

26、在一些實施方式中，在本發明的上述試劑盒中，第四分化培養基中的il-3的終濃度為5-50ng/ml，il-7的終濃度為5-50ng/ml，il-15的終濃度為5-50ng/ml，scf的終濃度為5-50ng/ml，flt3配體的終濃度為5-50ng/ml；優選地，il-3的終濃度為5ng/ml，il-7的終濃度為20ng/ml，il-15的終濃度為10ng/ml，scf的終濃度為20ng/ml，flt3配體的終濃度為10ng/ml。

27、在一些實施方式中，在本發明的上述試劑盒中，第五分化培養基中的il-7的終濃度為5-50ng/ml，il-15的終濃度為5-50ng/ml，scf的終濃度為5-50ng/ml，flt3配體的終濃度為5-50ng/ml；優選地，il-7的終濃度為20ng/ml，il-15的終濃度為10ng/ml，scf的終濃度為20ng/ml，flt3配體的終濃度為10ng/ml。

28、本發明的技術方案添加物更少更經濟，同時采用2d(平面)分步誘導，比常規3d(立體)培養更簡單易于操作。獲得的nk細胞活力好、純度高，nk細胞的含量達到70％及以上。