本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種抑制水稻黑條矮縮病毒(rice?black-streaked?dwarf?virus，rbsdv)的dsrna及其制備方法和應用。

背景技術：

1、水稻黑條矮縮病是由介體灰飛虱以持久性方式傳播rbsdv引起的水稻病毒病害。水稻植株受到水稻黑條矮縮病毒侵染后的典型癥狀是發病水稻明顯矮縮，葉片短小僵直、深綠，新抽出的葉片變得扭曲皺縮，發病初期葉片背面的葉脈和莖稈上有蠟淚狀白色凸起，后來變成黑褐色的短條瘤狀凸起，水稻不抽穗或穗小，最終可導致嚴重減產。我國自本世紀初由于主推的水稻品種不抗黑條矮縮病，致使該病在浙江、上海、江蘇、安徽等地廣泛流行，使其上升為水稻的主要病害，一般發病田的產量損失為10％～40％，嚴重田塊發病率達80％-90％，產量損失7-8成，有的甚至顆粒無收，對農業生產構成了嚴重威脅。rbsdv除侵染水稻外，還能夠侵染玉米、小麥、大麥、高粱、粟等禾本科糧食作物，以及稗草、看麥娘和狗尾草等禾本科雜草。

2、rna干擾(rnai)是dsrna(double-stranded?rna)識別具有同源互補序列的mrna并抑制其表達甚至降解其分子的過程，也被稱為基因沉默，該途徑在真核生物抵御生物脅迫中發揮了非常重要的作用。自然界存在大量的跨界小rna在植物-病原間進行雙向傳遞。在植物表面噴施源于病原菌致病基因的dsrna，可以誘導植物體內的rna沉默體系，從而抑制病毒基因的表達并降低其致病性，有效保護植物免受病原菌危害。因此，探索基于rbsdv基因組的dsrna進行病毒病防治，解決生產中防治病毒病藥劑缺乏、防蟲施藥造成污染以及抗性品種資源稀缺等問題，是綠色環保的農業新技術。

技術實現思路

1、發明目的：本發明的第一目的在于提供一種通過靶向水稻黑條矮縮病毒rbsdv，從而抑制水稻黑條矮縮病的dsrna。

2、本發明還要解決的技術問題是提供了該dsrna在抑制水稻黑條矮縮病毒中的應用。

3、技術方案：本發明中抑制rbsdv致病性的dsrna，其rna序列如seq?id?no.3所示。

4、本發明的上述dsrna的制備方法，包括以下步驟：以rbsdv的cdna為模板，用核苷酸序列如seq?id?no.1～2所示的引物進行pcr擴增，獲得核苷酸序列如seq?id?no.4所示的dsrna片段，將dsrna片段連接到表達載體上，構建重組載體；將含有dsrna片段的重組表達載體導入到大腸桿菌ht115中培養；通過iptg誘導dsrna產生，培養收集菌液。

5、其中，所述表達載體為商業購買pet28載體。

6、進一步地，所述iptg誘導時，大腸桿菌ht115的初始濃度為od600＝0.4-0.8；iptg濃度為0.5-1.0mmol/ml；培養時間為4-5h。

7、本發明的上述dsrna在制備防治水稻黑條矮縮病的藥劑中的應用。

8、進一步地，所述水稻黑條矮縮病由水稻黑條矮縮病毒rbsdv引起。

9、進一步地，所述dsrna的濃度為1.50-2.0μg/μl。

10、本發明藥劑可噴施于水稻的葉片或莖稈。

11、有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下突出的顯著優點：

12、1、本發明的dsrna靶向編碼水稻黑條矮縮病毒rbsdv?p6蛋白的基因s6，在病毒侵染早期能夠起到防治水稻黑條矮縮病的作用；

13、2、細菌誘導dsrna成本低，產量高，工藝簡單，并且特異性強，抗病毒效果明顯，并且安全環保，使得rnai技術更好應用于水稻黑條矮縮病防治。

技術特征：

1.一種抑制水稻黑條矮縮病毒致病性的dsrna，其特征在于，所述dsrna的序列如seqid?no.3所示。

2.權利要求1所述的dsrna的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以rbsdv的cdna為模板，用核苷酸序列如seq?id?no.1～2所示的引物進行pcr擴增，獲得核苷酸序列如seq?idno.4所示的dsrna片段，將dsrna片段連接到表達載體上，構建重組載體；將含有dsrna片段的重組表達載體導入到大腸桿菌ht115中培養；通過iptg誘導dsrna產生，培養收集菌液。

3.根據權利要求2所述的dsrna的制備方法，其特征在于，所述表達載體為pet28載體。

4.根據權利要求2所述的dsrna的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌ht115初始濃度為od600＝0.4-0.6。

5.根據權利要求2所述的dsrna的制備方法，其特征在于，所述iptg濃度為0.5-1.0mmol/ml。

6.根據權利要求2所述的dsrna的制備方法，其特征在于，所述培養時間為4-5h。

7.權利要求1所述的dsrna在防治水稻黑條矮縮病上的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述dsrna的濃度為1.0-2.0μg/μl。

9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用包括將dsrna水溶液噴施在水稻葉片或莖稈。

技術總結
本發明公開了一種抑制水稻黑條矮縮病毒致病性的dsRNA及其應用。本發明公開的dsRNA靶向水稻黑條矮縮病毒編碼RBSDV?P6蛋白的基因S6，從而抑制水稻黑條矮縮病毒在植物體內的復制及表達水平，進而有效減輕水稻黑條矮縮病的發生。本發明公開的dsRNA從病毒侵染前實施抑制，大大降低了水稻黑條矮縮病毒的致病力；本發明的dsRNA用于制備的生物抗病毒劑提升植株抗病效果明顯，安全環保且制備工藝簡單，適用性更強。

技術研發人員：蘭瑩,周彤,趙弘巍,陳盼,杜琳琳,李晨羊,林峰
受保護的技術使用者：江蘇省農業科學院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24