本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種抗p-tau181蛋白單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、阿爾茨海默癥(alzheimer's?disease，ad)是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其特征是認(rèn)知功能逐漸下降。在ad患者的大腦中，tau蛋白發(fā)生過度磷酸化，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary?tangles，nfts)。其中，磷酸化tau蛋白181位點(diǎn)(p-tau181)被認(rèn)為是早期ad的一個(gè)非常敏感和特異的生物標(biāo)志物。因此，開發(fā)能夠特異性識(shí)別p-tau181的抗體對(duì)于ad的早期診斷具有重要意義。

2、現(xiàn)有的技術(shù)主要采用免疫學(xué)方法，通過制備針對(duì)特定磷酸化位點(diǎn)的抗體來檢測(cè)ad中的病理改變。例如，一些研究已經(jīng)開發(fā)出能夠識(shí)別p-tau181的抗體，并將其用于ad的診斷。然而，這些抗體在特異性和靈敏度上可能存在一定局限，因?yàn)槠湟部赡芘c非磷酸化tau蛋白或其他磷酸化位點(diǎn)交叉反應(yīng)。

3、盡管現(xiàn)有的技術(shù)已經(jīng)在ad的診斷中發(fā)揮了重要作用，但仍存在一些挑戰(zhàn)。首先，現(xiàn)有的抗體可能在特異性和靈敏度上有所不足，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，從而影響診斷的準(zhǔn)確性。其次，現(xiàn)有的抗體篩選方法無法有效排除與非磷酸化tau蛋白或其他磷酸化位點(diǎn)交叉反應(yīng)的抗體，也可能影響抗體的特異性。

4、因此，本領(lǐng)域亟需一種特異性結(jié)合p-tau181蛋白的抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種特異性結(jié)合p-tau181蛋白的抗體及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供基于p-tau181蛋白抗體的抗體、嵌合抗原受體、融合蛋白、重組蛋白及其編碼核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、免疫偶聯(lián)物等，并提供包括以上活性成分的藥物組合物。

3、本發(fā)明的又一目的在于提供預(yù)防和/或治療p-tau181蛋白高表達(dá)的疾病的方法，以及p-tau181蛋白高表達(dá)的疾病的診斷方法。

4、本發(fā)明的第一方面，提供了一種靶向p-tau181蛋白的抗體或其抗體結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自下組的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：

5、(z1)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:1所示的vh-cdr1，seq?id?no:2所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；和/或

6、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:4所示的vl-cdr1，seq?id?no:5所示的vl-cdr2，和seq?id?no:6所示的vl-cdr3；或

7、(z2)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:7所示的vh-cdr1，seq?id?no:8所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；和/或

8、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:9所示的vl-cdr1，seq?id?no:10所示的vl-cdr2，和seq?id?no:11所示的vl-cdr3；或

9、(z3)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:12所示的vh-cdr1，seq?id?no:13所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；和/或

10、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:4所示的vl-cdr1，seq?id?no:10所示的vl-cdr2，和seq?id?no:11所示的vl-cdr3。

11、在另一優(yōu)選例中，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:22具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和/或

12、所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:23具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

13、在另一優(yōu)選例中，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:24具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和/或

14、所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:25具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

15、在另一優(yōu)選例中，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:26具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和/或

16、所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seq?id?no:27具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

17、在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)包括所述的三個(gè)重鏈cdr以及用于連接重鏈cdr的重鏈框架區(qū)；所述輕鏈可變區(qū)包括所述的三個(gè)輕鏈cdr以及用于連接輕鏈cdr的輕鏈框架區(qū)。

18、在另一優(yōu)選例中，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)還包括fr區(qū)。

19、在另一優(yōu)選例中，所述重鏈可變區(qū)包含鼠源或人源的fr區(qū)，和/或所述輕鏈可變區(qū)包含鼠源或人源的fr區(qū)。

20、在另一優(yōu)選例中，所述重鏈fr區(qū)包含seq?id?no:14所示的fr-h1、seq?id?no:15所示的fr-h2、seq?id?no:16所示的fr-h3、和seq?id?no:17所示的fr-h4。

21、在另一優(yōu)選例中，所述輕鏈fr區(qū)包含seq?id?no:18所示的fr-l1、seq?id?no:19所示的fr-l2、seq?id?no:20所示的fr-l3、和seq?id?no:21所示的fr-l4。

22、在另一優(yōu)選例中，所述靶向p-tau181的抗體或其抗原結(jié)合片段選自下組：fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、fv、單鏈fv抗體(“scfv”)、雙scfv、(scfv)2、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、二硫鍵穩(wěn)定的fv蛋白(“dsfv”)，或其組合。

23、在另一優(yōu)選例中，所述抗體特異性結(jié)合于p-tau181蛋白或其衍生蛋白。

24、在另一優(yōu)選例中，所述抗體特異性能夠結(jié)合兔、人、小鼠和食蟹猴來源的p-tau181蛋白。

25、在另一優(yōu)選例中，所述抗體的輕鏈還包括輕鏈恒定區(qū)。

26、在另一優(yōu)選例中，所述的輕鏈恒定區(qū)為人源、鼠源或兔源的，較佳地為人源的或兔源的。

27、在另一優(yōu)選例中，所述的抗體的重鏈還包括重鏈恒定區(qū)。

28、在另一優(yōu)選例中，所述的重鏈恒定區(qū)為人源、鼠源或兔源的，較佳地為人源的或兔源的。

29、在另一優(yōu)選例中，所述的抗體為雙鏈抗體、或單鏈抗體。

30、在另一優(yōu)選例中，所述的抗體為單克隆抗體。

31、在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括單特異性、雙特異性、三特異性抗體或多特異性抗體。

32、本發(fā)明第二方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白包含：

33、(i)如本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段；和

34、(ii)任選的協(xié)助表達(dá)和/或純化的標(biāo)簽序列。

35、在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽序列包括6his標(biāo)簽、gggs序列、flag標(biāo)簽。

36、在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

37、在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白為融合蛋白。

38、在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白為單特異性抗體(即抗p-tau181蛋白的單特異性抗體)、雙特異性抗體、或多特異性抗體(如三特異性抗體)。

39、在另一優(yōu)選例中，所述的雙特異性抗體或多特異性抗體不僅抗p-tau181蛋白，還特異性結(jié)合于額外的靶抗原(如其他的阿爾茨海默病抗原)。

40、在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白為單體、二聚體、或多聚體。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白還包括與所述元件(i)融合在一起的額外的融合元件(或融合多肽片段)。

42、本發(fā)明第三方面，提供了一種嵌合抗原受體car，所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有靶向p-tau181蛋白的抗體單鏈可變區(qū)序列scfv，所述scfv的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)包括以下的互補(bǔ)決定區(qū)cdr：

43、(z1)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:1所示的vh-cdr1，seq?id?no:2所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；以及

44、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:4所示的vl-cdr1，seq?id?no:5所示的vl-cdr2，和seq?id?no:6所示的vl-cdr3；或

45、(z2)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:7所示的vh-cdr1，seq?id?no:8所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；以及

46、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:9所示的vl-cdr1，seq?id?no:10所示的vl-cdr2，和seq?id?no:11所示的vl-cdr3；或

47、(z3)所述重鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:12所示的vh-cdr1，seq?id?no:13所示的vh-cdr2，和seq?id?no:3所示的vh-cdr3；以及

48、所述輕鏈可變區(qū)包含以下3個(gè)cdr：seq?id?no:4所示的vl-cdr1，seq?id?no:10所示的vl-cdr2，和seq?id?no:11所示的vl-cdr3。

49、本發(fā)明第四方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼如本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白，或如本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體car。

50、在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸包含編碼所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列。

51、在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸包含如seq?id?no:5所示的重鏈可變區(qū)編碼序列。

52、在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸包含如seq?id?no:12所示的輕鏈可變區(qū)編碼序列。

53、本發(fā)明第五方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。

54、在另一優(yōu)選例中，所述的載體選自下組：dna、rna、質(zhì)粒、慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、轉(zhuǎn)座子、或其組合。

55、在另一優(yōu)選例中，所述載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

56、本發(fā)明第六方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明第五方面所述的載體或其基因組中整合有外源的本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸。

57、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為分離的細(xì)胞，和/或所述細(xì)胞為基因工程化的細(xì)胞。

58、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

59、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為nk細(xì)胞或t細(xì)胞。

60、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為工程化的免疫細(xì)胞。

61、本發(fā)明第七方面，提供了一種制備car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞的方法，所述的car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體，包括以下步驟：

62、將本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸或本發(fā)明第五方面所述的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入nk細(xì)胞或t細(xì)胞內(nèi)，從而獲得所述car-nk細(xì)胞或car-t細(xì)胞。

63、本發(fā)明第八方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第五方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞、或其組合，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

64、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為制劑，優(yōu)選為液態(tài)制劑。

65、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型為注射劑。

66、在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括0.01～99.99％的如本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、如本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第五方面所述的載體、如本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞、或其組合和0.01～99.99％的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的質(zhì)量百分比。

67、在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于檢測(cè)阿爾茨海默病。

68、本發(fā)明第九方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，所述的免疫偶聯(lián)物含有：

69、(a)抗體部分，所述抗體部分選自下組：如本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、或其組合；和

70、(b)與所述抗體部分偶聯(lián)的偶聯(lián)部分，所述偶聯(lián)部分選自下組：可檢測(cè)標(biāo)記物、藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、酶、或其組合。

71、在另一優(yōu)選例中，所述偶聯(lián)物選自：熒光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、mri(磁共振成像)或ct(電子計(jì)算機(jī)x射線斷層掃描技術(shù))造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物的酶、放射性核素、生物毒素、細(xì)胞因子(如il-2等)、抗體、抗體fc片段、抗體scfv片段、金納米顆粒/納米棒、病毒顆粒、脂質(zhì)體、納米磁粒、前藥激活酶(例如，dt-心肌黃酶(dtd)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)(bphl))、化療劑(例如，順鉑)或任何形式的納米顆粒等。

72、本發(fā)明第十方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、本發(fā)明第三方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第四方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第五方面所述的載體、本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞、本發(fā)明第八方面所述的藥物組合物或本發(fā)明第九方面所述的免疫偶聯(lián)物的用途，所述用途包括選自下組的一種或多種用途：

73、(a)用于制備檢測(cè)p-tau181蛋白的檢測(cè)試劑或試劑盒；和/或

74、(b)用于制備預(yù)防和/或治療p-tau181蛋白相關(guān)疾病的藥物或制劑。

75、在另一優(yōu)選例中，所述p-tau181蛋白相關(guān)疾病為阿爾茨海默病。

76、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑或試劑盒用于檢測(cè)p-tau181蛋白的表達(dá)水平，從而診斷阿爾茨海默病。

77、在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種體外檢測(cè)(包括診斷性或非診斷性)樣品中p-tau181蛋白的方法，所述方法包括步驟：

78、(1)將樣品與本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、或本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白接觸；

79、(2)檢測(cè)是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在p-tau181蛋白。

80、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)為體外非治療非診斷目的的。

81、在另一優(yōu)選例中，所述方法為細(xì)胞免疫化學(xué)(immunocytochemistry?staning，icc)檢測(cè)方法，或免疫組化(immunohistochemistryihc)檢測(cè)方法，或whole?cell(全細(xì)胞)elisa檢測(cè)方法，cell?lysate(細(xì)胞裂解物)elisa檢測(cè)方法。

82、在另一優(yōu)選例中，所述方法用于診斷阿爾茨海默病。

83、在本發(fā)明的第十二方面，提供了一種重組多肽的制備方法，該方法包含：

84、(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞；

85、(b)從培養(yǎng)物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，或本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白。

86、在本發(fā)明的第十三方面，提供了一種檢測(cè)板，所述的檢測(cè)板包括：基片(支撐板)和測(cè)試條，所述的測(cè)試條含有本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、本發(fā)明第九方面所述的免疫偶聯(lián)物、或其組合。

87、在本發(fā)明的第十四方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括：

88、(1)第一容器，所述第一容器中含有本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段；和/或

89、(2)第二容器，所述第二容器中含有抗所述抗體的二抗；

90、或者，所述試劑盒含有本發(fā)明第十三方面所述的檢測(cè)板。

91、在本發(fā)明的第十五方面，提供了一種治療與p-tau181蛋白表達(dá)或功能異常相關(guān)的疾病的方法，包括給需要治療的對(duì)象施用適量的本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白、本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞或本發(fā)明第八方面所述的藥物組合物。

92、在另一優(yōu)選例中，所述與p-tau181蛋白表達(dá)或功能異常相關(guān)的疾病為阿爾茨海默病。

93、在本發(fā)明的第十六方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，或如本發(fā)明第二方面所述的重組蛋白，或如本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞和/或如本發(fā)明第八方面所述的藥物組合物在制備用于治療p-tau181蛋白表達(dá)或功能異常相關(guān)的疾病的藥物中的用途。

94、在另一優(yōu)選例中，所述的p-tau181蛋白表達(dá)異常指p-tau181蛋白過度表達(dá)。

95、在另一優(yōu)選例中，所述的過度表達(dá)指p-tau181蛋白的表達(dá)量(f1)與生理情況下表達(dá)量(f0)之比(即f1/f0)≥1.2，優(yōu)選地≥1.5，更優(yōu)選地≥2.00。

96、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。