本發明屬于化學合成領域，具體涉及到一種巴豆酰化檢測探針及其制備方法和應用。

背景技術：

1、賴氨酸酰化影響染色質結構、基因表達、酶活性以及蛋白質-蛋白質相互作用。已經發現超過十種賴氨酸酰化類型，包括乳酸化、巴豆酰化、丙二酰化和琥珀酰化等。巴豆酰化于2011年被發現，通過在賴氨酸側鏈氨基上添加一個含有雙鍵的四碳基團形成的共價修飾。巴豆酰化已被證明與多種生理和病理過程相關，包括細胞分化、癌癥發展、腎臟疾病、神經疾病以及代謝紊亂。

2、

3、目前檢測巴豆酰化有兩種思路。第一種思路是基于泛抗體的富集技術。該技術需求特異性抗體，因而存在檢測時成本較高，具有序列偏好性，以及難以動態監測巴豆酰化的周轉等缺點(cell，2011，146，1015-1027)。第二種檢測思路是利用三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽與巴豆酰化的α，β不飽和酸發生的邁克爾加成反應(j.am.chem.soc.，2018，140，4757-4760.)，用于巴豆酰化蛋白的檢測。但是該方法僅僅應用于單蛋白水平，但因檢測通量較低，難以實現高通量的底物蛋白及修飾位點的鑒定。由于目前檢測巴豆酰化蛋白底物及修飾位點存在上述的缺陷，迫切需要開發高效、經濟且全面的方法，用于研究哺乳動物系統中的巴豆酰化底物蛋白及其功能。近年來，化學蛋白質組學策略已成為研究蛋白質翻譯后修飾(ptms)的有力替代方法。

4、由于目前檢測巴豆酰化蛋白底物及修飾位點存在上述的缺陷，迫切需要開發高效、經濟且全面的方法，用于研究哺乳動物系統中的巴豆酰化底物蛋白及其功能。近年來，化學蛋白質組學策略已成為研究蛋白質翻譯后修飾(ptms)的有力替代方法。將具有生物正交功能基(如炔基和疊氮基)的化學探針在細胞或動物中孵育/施用，可以通過代謝標記選擇性地在特定修飾位點將這些功能基裝載到目標蛋白上。通過生物正交化學反應(如銅(i)催化的炔基-疊氮基環加成反應，cuaac)，熒光染料和/或生物素可以正交地連接到修飾位點。這種方法實現了代謝標記蛋白的選擇性可視化、富集和鑒定。

技術實現思路

1、發明目的：本發明的目的是克服上述現有技術存在的不足，提供一種巴豆酰化檢測探針及其制備方法和應用。

2、為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：

3、一種巴豆酰化檢測探針，具有式i所示的結構：

4、

5、其中，n為1或2。

6、一種巴豆酰化檢測探針的制備方法，用于制備所述的巴豆酰化檢測探針，包括如下步驟：

7、

8、其中：n為1或2，在化合物ii制備化合物iii的過程中，所述氧化劑為dmp或ibx，化合物ii與甲氧羰基亞甲基三苯基正磷、氧化劑的摩爾比范圍為1：1～2：2～3；在化合物iii制備化合物iv的過程中，所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，化合物iii與堿的摩爾比范圍為1：5～6；在化合物iv制備化合物i的過程中，所述堿為碳酸氫鈉、碳酸鈉或氫氧化鈉，化合物iv與堿的摩爾比范圍為1：1～1.1。

9、一種所述的巴豆酰化檢測探針的應用，所述探針可用于巴豆酰化蛋白的熒光檢測。

10、所述探針可用于從細胞、組織中下拉巴豆酰化蛋白。

11、所述探針可用于鑒定巴豆酰化蛋白。

12、所述巴豆酰化蛋白分為組蛋白或非組蛋白，其中，所述非組蛋白為ncl(核仁蛋白)、hmgb1(高遷移率族蛋白b1)、hmgn2(高遷移率基團核小體結合域2)、ddx21(dead-boxrna解旋酶)、hmgb3(高遷移率族蛋白b3)、parp1(多聚adp核糖聚合酶1)、tmpo(胸腺生成素)、p53(p53腫瘤蛋白)、setlp(set樣蛋白)、wiz(wingsless相關鋅指蛋白)、pi2r(前列腺素i2受體)、ube2t(泛素結合酶ube2t)或zn735(鋅指蛋白735)。

13、所述探針可用于鑒定巴豆酰化的修飾位點。

14、所述鑒定巴豆酰化的修飾位點的方法如下：將探針與細胞共孵育進行蛋白標記，然后制備細胞的全裂解液，再使用疊氮生物素對探針標記的蛋白質進行生物素修飾，最后利用鏈霉親和素偶聯磁珠將探針標記的蛋白質從蛋白組中分離，對探針標記的蛋白質進行質譜檢測分析，所述疊氮生物素為疊氮-生物素(azide-biotin)或疊氮-dadps-生物素。

15、所述探針可通過定量化學蛋白質組學鑒定巴豆酰化酶調控的巴豆酰化位點；其中，所述巴豆酰化酶為去乙酰化酶。

16、一種包含巴豆酰化檢測探針的試劑盒。

17、有益效果：本發明公開了一種巴豆酰化檢測探針及其制備方法和應用，制備方法包括：以炔醇(化合物ii)為原料，氧化劑的作用下與甲氧羰基亞甲基三苯基正磷反應得到甲酯類化合物(化合物iii)，在堿的作用下水解得到酸(化合物iv)，最后與堿反應，過濾，凍干得到探針分子(化合物i)。將具有炔基的化學探針(化合物i)在細胞中施用，通過代謝標記選擇性地在特定修飾位點將炔基裝載到目標蛋白上，通過生物正交化學反應，熒光染料可以正交地連接到修飾位點，從而使探針用于細胞中對巴豆酰化蛋白進行熒光成像并鑒定巴豆酰化的修飾底物與位點，不僅鑒別出新的巴豆酰化位點，還鑒別出新的巴豆酰化修飾底物，利用該探針可以通過定量化學蛋白質組學確定去乙酰化酶(hdacs)調控的巴豆酰化位點。

18、說明書中涉及的反應試劑的縮寫如下所示：

19、dmp：戴斯-馬丁高碘烷；

20、ibx：2-碘酰基苯甲酸

21、dcm：二氯甲烷；

22、nahco3：碳酸氫鈉；

23、naoh：氫氧化鈉；

24、h2o：水；

25、hcl：鹽酸；

26、ep管：離心管。

技術特征：

1.一種巴豆酰化檢測探針，其特征在于，具有式i所示的結構：

2.一種巴豆酰化檢測探針的制備方法，用于制備權利要求1所述的巴豆酰化探針，其特征在于，包括如下步驟：

3.一種權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的應用，其特征在于，所述探針可用于巴豆酰化蛋白的熒光檢測。

4.一種權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的應用，其特征在于，所述探針可用于從細胞、組織中下拉巴豆酰化蛋白。

5.一種權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的應用，其特征在于，所述探針可用于鑒定巴豆酰化蛋白。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述巴豆酰化蛋白分為組蛋白或非組蛋白，其中，所述非組蛋白為ncl、hmgb1、hmgn2、ddx21、hmgb3、parp1、tmpo、p53、setlp、wiz、pi2r、ube2t或zn735。

7.一種權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的應用，其特征在于，所述探針可用于鑒定巴豆酰化的修飾位點。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述鑒定巴豆酰化的修飾位點的方法如下：將探針與細胞共孵育進行蛋白標記，然后制備細胞的全裂解液，再使用疊氮生物素對探針標記的蛋白質進行生物素修飾，最后利用鏈霉親和素偶聯磁珠將探針標記的蛋白質從蛋白組中分離，對探針標記的蛋白質進行質譜檢測分析。

9.一種權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的應用，其特征在于，所述探針可通過定量化學蛋白質組學鑒定巴豆酰化酶調控的巴豆酰化位點；其中，所述巴豆酰化酶為去乙酰化酶。

10.一種包含權利要求1所述的巴豆酰化檢測探針的試劑盒。

技術總結
本發明公開了一種巴豆酰化檢測探針及其制備方法和應用，制備方法包括：以炔醇(化合物II)為原料，氧化劑的作用下與甲氧羰基亞甲基三苯基正磷反應得到甲酯類化合物(化合物III)，在堿的作用下水解得到酸(化合物IV)，最后與堿反應，過濾，凍干得到探針分子(化合物I)。將具有炔基的化學探針(化合物I)在細胞中施用，通過代謝標記選擇性地在特定修飾位點將炔基裝載到目標蛋白上，通過生物正交化學反應，熒光染料可以正交地連接到修飾位點，從而使探針用于細胞中對巴豆酰化蛋白進行熒光成像并鑒定巴豆酰化的修飾底物與位點，利用該探針可以通過定量化學蛋白質組學確定組蛋白去乙酰化酶(HDACs)調控的巴豆酰化位點。

技術研發人員：王初,周元飛,袁守麗,馬斌
受保護的技術使用者：北京大學
技術研發日：
技術公布日：2025/3/20