本發明屬于藥物毒性測試，涉及心臟類器官中藥提取物毒性測試，具體涉及一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片構建及應用。

背景技術：

1、心臟類器官是一類由多種心臟類型細胞組成的三維培養物，包括心肌細胞等，其與體內心臟高度相似，能夠模擬心臟的三維結構和生理功能。人多能干細胞具有無限增殖能力，可以在體外分化為幾乎所有人體細胞，包括心臟組成細胞，因此人多能干細胞是構建心臟類器官的理想種子細胞來源。

2、中藥提取物在中醫藥領域應用廣泛，安全性評估是不可或缺的一環。現有技術中，多通過動物實驗進行，通過觀察實驗動物的中毒癥狀和死亡情況，可以確定提取物的急性毒性級別，了解其可能的致死劑量，從而評估其對人體的潛在危害。心臟類器官能夠模擬心臟的三維結構和生理功能，可基于此評估不同中藥藥物對心臟類器官的毒性，將有助于減少實驗動物的使用，同時還能提高檢測效率和成功率。

技術實現思路

1、本發明基于上述思路進行，目的在于提供一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片及應用。

2、為了實現該目的，本發明提供的技術方案如下：

3、本發明第一方面，提供了一種用于人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試的組件，包括：多條微流控孔道，每條微流控孔道兩端分別設置有培養基注入或流出孔，中間部分設置有多個給藥孔；多個心臟類器官培養室，分別設置在給藥孔上，底端采用無菌混合纖維素酯半透膜密封。微型細胞培養室進行心臟類器官培養，微流控通道進行培養基加入維持心臟類器官活性及中藥提取物加入評估中藥毒性。

4、優選的，多條微流控孔道之間串聯連接，外接蠕動泵，循環提供培養基。

5、優選的，心臟類器官培養室為pdms組織芯片，使用光刻圖案模具對pdms進行圖案化后進行pdms澆注和固化，pdms在60℃下固化3小時，從硅片上剝離和切割固化pdms模具，并等離子體處理pdms芯片；

6、無菌混合纖維素酯半透膜為0.45μm無菌混合纖維素酯膜。

7、本發明第二方面，提供了一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片的構建方法，通過將心臟類器官構建和上述所述的組件結合實現，包括如下步驟：

8、(1)心臟類器官構建

9、將人多能干細胞球依次采用心臟類器官分化培養基a進行第一次分化培養、心臟類器官分化培養基b第二次分化培養和心臟類器官分化培養基c第三次分化培養，得到心臟類器官，其中培養過程都采用基質膠包埋培養法；

10、(2)心臟類器官培養

11、收集步驟(1)構建得到的心臟類器官，基質膠重懸后，置于無菌混合纖維素酯半透膜上；將芯片置于37℃、5％co2培養箱中培養，心臟類器官培養基從培養基注入，啟動蠕動泵，循環提供培養基，心臟類器官在類器官培養室內自組裝，逐漸生長成為成熟的類器官。

12、優選的，步驟(1)中，三個分化培養基的組分組成如下：

13、心臟類器官分化培養基a由如下組分組成：6μg/ml?chir99021、1％50×b27添加劑、500μg/ml?l-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽、rpmi-1640培養基；

14、心臟類器官分化培養基b由如下組分組成：5.5μg/mlky02111、1％50×b27添加劑、500ug/ml?l-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽、rpmi-1640培養基；

15、心臟類器官分化培養基c由如下組分組成：1％50×b27添加劑、500ug/ml?l-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽、rpmi-1640培養基組成。

16、進一步優選，步驟(1)中心臟類器官構建包括如下步驟：

17、1)心臟類器官分化培養基a培養：將干細胞得到的培養產物從培養基吸出，向每個孔中加入5-10μl基質膠，使得多功能干細胞包裹在基質膠中，基質膠凝固后加入每個孔里再加入200μl心臟類器官分化培養基a，放回co2培養箱中，培養48h，得到第一次分化培養產物；

18、2)心臟類器官分化培養基b培養：將上述1)得到第一次分化培養產物，吸棄類器官分化培養基a；再向每個孔中加入5μl基質膠，確保細胞球都包裹在基質膠中；隨后將細胞板子放回到co2培養箱中，放置30min，使基質膠凝固；向每個孔里加入200μl類器官分化培養b，放回co2培養箱中，培養48h，得到第二次分化培養產物；

19、3)心臟類器官分化培養基c培養：將上述2)得到第二次分化培養產物，吸棄類器官分化培養基b；再向每個孔中加入200μl類器官分化培養基c，放回co2培養箱中，培養48h；此后每2天更換一次類器官分化培養基c，得到第三次分化培養產物，在心臟類器官分化第7-10天出現跳動，得到心臟類器官。

20、本發明特色優勢的，根據該方法構建心臟類器官成功率大于85％，可直接用于對藥物毒性檢測。

21、本發明第三方面，提供了一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片，采用上述所述的方法制備得到，可用于包括中藥提取物在內的藥物毒性檢測。

22、本發明第四方面，提供了利用芯片進行心臟類器官中藥提取物毒性測試的方法，包括如下步驟：提取中藥提取物，按照不同藥物濃度加入心臟類器官培養基中，重新把芯片置于37℃、5％co2培養箱中培養，分別于特定時間點顯微鏡下觀察細胞情況，并在最后觀察時間點后測量中藥提取物對心臟類器官的毒性。

23、優選的，測試過程中，在24h、48h、72h、96h顯微鏡下觀察細胞情況。96h小時后測量中藥提取物對心臟類器官的毒性，包括檢測細胞存活率、細胞膜的完整性、細胞內酶活性變化、細胞凋亡指標；該芯片能夠滿足熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者高分辨率攝像設備拍照，能夠觀察和記錄心臟細胞的形態結構、活動狀態、細胞特內特定熒光標記物的變化等。

24、本發明特色優勢的，該人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片評估中藥提取物的毒性評價指標多樣，臨床一致性較高。

25、發明的作用與效果

26、本發明公開了一種多功能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片，包括多個微型細胞培養室和微流控孔道，能夠模擬心臟器官的反應，有助于評估中藥的毒性并提供關于中藥的安全性和有效性信息，最終能夠減少實驗動物是使用，提高動物福利。。

技術特征：

1.一種用于人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試的組件，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的用于人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試的組件，其特征在于，所述多條微流控孔道之間串聯連接，外接蠕動泵，循環提供培養基。

3.根據權利要求1所述的用于人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試的組件，其特征在于，心臟類器官培養室為pdms組織芯片，使用光刻圖案模具對pdms進行圖案化后進行pdms澆注和固化，pdms在60℃下固化3小時，從硅片上剝離和切割固化pdms模具，并等離子體處理pdms芯片；

4.一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片的構建方法，其特征在于，通過將心臟類器官構建和權利要求1～3任一項所述的組件結合實現，包括如下步驟：

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，三個分化培養基的組分組成如下：

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中心臟類器官構建包括如下步驟：

7.一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片，其特征在于采用權利要求4～6任一項所述的方法制備得到。

8.采用權利要求7所述的芯片進行心臟類器官中藥提取物毒性測試的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，分別于24h、48h、72h、96h顯微鏡下觀察細胞情況，并在96h小時后測量中藥提取物對心臟類器官的毒性。

技術總結
本發明提供了一種人多能干細胞來源的心臟類器官中藥提取物毒性測試芯片構建及應用。該芯片包括多個微型細胞培養室和微流控孔道；所述微型細胞培養室進行心臟類器官培養，微流控通道進行培養基加入維持心臟類器官活性及中藥提取物加入評估中藥毒性。本發明通過模擬心臟器官的反應，有助于評估中藥的毒性并提供關于中藥的安全性和有效性信息，最終能夠減少實驗動物使用，提高動物福利。

技術研發人員：楊雅薇,伍鋒,章偉,樊民,馮燦
受保護的技術使用者：上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28