本發明涉及分子標記輔助育種，尤其涉及華甘蜜橘indel分子標記及引物對、應用和鑒定方法。

背景技術：

1、柑橘屬于蕓香科植物，是世界上重要的水果種類，在140多個國家和地區均有種植。柑橘種類繁多，生產上主要涉及三屬八大類，三屬是指柑橘屬、金柑屬和枳屬，八大類包括柑橘屬的寬皮柑橘類、甜橙類、酸橙類、柚和葡萄柚類、枸櫞類、檸檬類，以及金柑類和枳類。

2、常見的柑橘類水果大多屬于柑橘屬，不僅外觀色澤鮮艷，形狀美觀，而且營養豐富，含有多種維生素、類胡蘿卜素以及香氣物質；枳屬由于其較強的抗寒和抗病性，常被用作砧木；而金柑屬果實較小，有的品種已被培養成觀賞植物，用于庭院和盆栽，還有的野生種已被開發為研究柑橘功能基因組的模式植物，用作遺傳轉化材料。

3、產自江西省南豐縣的南豐蜜橘是寬皮柑橘類中較古老的品種，選自乳橘，有著1300年的栽培歷史，如今在江西、浙江、福建、湖南、湖北、四川、廣西等地均有種植。該品種汁多，香味濃郁，豐產性好，品質優良，抗寒性強，抗潰瘍病能力較強，但囊衣稍厚，化渣性較差。通過芽變和自然雜交等育種手段，南豐蜜橘逐漸形成了兩個品種群，南豐蜜橘品種群和南豐廣桔品種群，前者包括早熟系、大果系、小果系和桂花蒂系，后者包括蜜廣和紅廣。蜜廣為南豐蜜橘和火橘雜交后代，雖然皮薄汁多、果肉細嫩化渣，但其香氣不如南豐蜜橘。

4、近幾年在江西省南豐縣下甘村發現幾株化渣優良的芽變優株，不僅果實化渣性顯著優于普通南豐蜜橘，而且香味濃郁，果實品質較好，有望成為柑橘新品種，開發此新品種不僅可以完善南豐蜜橘品種結構，還可為南豐蜜橘化渣性研究提供新的種質資源。

5、柑橘品種資源豐富，育種方式多樣，種屬之間親和性很強，而發生的多種變異又以無性繁殖方式保存下來，導致品種間具有復雜的遺傳背景。為了分析柑橘的遺傳多樣性和系統發育關系，開發了多種多樣的分子標記技術，分子標記是以個體間遺傳物質核苷酸序列差異為研究對象，在dna水平上直接反映品種之間的遺傳多樣性，從而可通過構建品種特異的指紋圖譜對新品種進行鑒定，該方法穩定又高效，可以有效排除環境引發的飾變，已逐步成為芽變鑒定的重要手段。依據檢測dna多態性手段的差異，可以將分子標記分為三種類型，第一類是以分子雜交技術為基礎的dna標記，如rflp；第二類是以pcr技術為基礎的dna標記，如aflp、ssr；第三類是基于單核苷酸多態性的dna標記，如snp。

6、由于indel標記主要是基于不同個體的基因組同源序列發生核苷酸片段的插入缺失而開發的，所以同源序列的獲得是其開發的前提。目前，隨著新一代測序技術的發展，全基因組重測序成本降低，時間周期縮短，且各種柑橘的參考基因組序列已公開，大大促進了indel標記的發展。indel標記為共顯性標記，具有位點豐富、多態性高、變異穩定、操作簡單等優點，常用于柑橘品種鑒定或物種之間的親緣關系鑒定。在本課題組前人研究的基礎上，使用indel標記快速鑒定化渣芽變優系‘華甘蜜橘’高效而準確，是值得廣泛推廣的分子標記技術。

技術實現思路

1、本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的華甘蜜橘indel分子標記及引物對、應用和鑒定方法。

2、本發明的目的之一在于，提供華甘蜜橘indel分子標記，該indel分子標記位于南豐蜜橘基因組chr3：2131843，其多態性為缺失/插入核酸序列；所述缺失核酸序列如seq?idno.1所示，所述插入核酸序列的堿基為胞嘧啶。

3、本發明的目的之二在于，提供用于擴增上述華甘蜜橘indel分子標記的引物對，包括：indel-7-f和indel-7-r；indel-7-f的核酸序列如seq?id?no.2所示，indel-7-r的核酸序列如seq?id?no.3所示。

4、本發明的目的之三在于，提供包含上述引物對的試劑盒。

5、優選地，上述試劑盒還包括進行pcr反應和/或電泳所需的試劑。

6、本發明的目的之四在于，提供上述華甘蜜橘indel分子標記、或上述引物對、或上述試劑盒在鑒定南豐蜜橘品種或品系中的應用，或在華甘蜜橘育種中的應用。

7、本發明的目的之五在于，提供鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，包括如下步驟：

8、(1)提取待測南豐蜜橘的基因組dna；

9、(2)以步驟(1)待測品dna為模板，應用上述引物對進行pcr擴增；

10、(3)對步驟(2)所得擴增產物進行電泳檢測或者測序檢測。

11、優選地，步驟(3)中采用測序檢測，若基因組chr3：2131843處堿基為胞嘧啶且缺失如seq?id?no.1的核酸序列，則該待測南豐蜜橘為華甘蜜橘，反之則為其他南豐蜜橘品種或品系。

12、優選地，步驟(3)中采用凝膠電泳檢測，其具體操作如下：將步驟(2)所得擴增產物置于瓊脂糖凝膠中電泳分離40min。

13、若上述凝膠電泳分離出現2個條帶，分別位于小于500bp處和500-750bp處，則該待測南豐蜜橘為華甘蜜橘。

14、若上述凝膠電泳分離未出現條帶，則該待測南豐蜜橘為大葉紅桔、小葉廣桔、小葉紅桔中一種。

15、若上述凝膠電泳分離僅出現1個條帶，且該條帶位于500-750bp處，則該待測南豐蜜橘為其余南豐蜜橘品種或品系中一種。

16、優選地，步驟(3)中采用毛細管電泳檢測，其具體操作如下：將步驟(2)所得擴增產物置于毛細管電泳中電泳分離20min。

17、若上述毛細管電泳分離出現2個條帶，分別為482bp和598bp，則該待測南豐蜜橘為華甘蜜橘；

18、若上述毛細管電泳分離未出現條帶，則該待測南豐蜜橘為大葉紅桔、小葉廣桔、小葉紅桔中一種；

19、若上述毛細管電泳分離僅出現1個578bp條帶，則該待測南豐蜜橘為其余南豐蜜橘品種或品系中一種。

20、本發明的目的之六在于，提供上述華甘蜜橘indel分子標記、或上述引物對、或上述試劑盒、或上述鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法在構建南豐蜜橘指紋圖譜中的應用。

21、本發明的有益效果包括但不限于：

22、(1)本發明所得indel位點并設計特異性引物，使鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法準確高效，結果穩定。

23、(2)本發明所得引物對indel-7在南豐蜜橘化渣優系‘華甘蜜橘’中擴增得到與其他品種/品系不同的dna片段，可用于該品種的快速鑒定。

24、(3)本發明開發出的indel標記操作簡單，檢測方便，僅需進行瓊脂糖凝膠電泳即可快速鑒定‘華甘蜜橘’，成本大大降低；

25、(4)本發明開發出的分子標記進一步印證‘華甘蜜橘’為一個新的南豐蜜橘芽變優系，豐富了南豐蜜橘品種結構，為之后的南豐蜜橘品種鑒定與遺傳育種奠定了基礎。

技術特征：

1.華甘蜜橘indel分子標記，其特征在于，所述indel分子標記位于南豐蜜橘基因組chr3：2131843，其多態性為缺失/插入核酸序列；

2.用于擴增如權利要求1所述華甘蜜橘indel分子標記的引物對，其特征在于，包括：indel-7-f和indel-7-r；indel-7-f的核酸序列如seq?id?no.2所示，indel-7-r的核酸序列如seq?id?no.3所示。

3.包含如權利要求2所述引物對的試劑盒。

4.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于，其還包括進行pcr反應和/或電泳所需的試劑。

5.如權利要求1所述華甘蜜橘indel分子標記，或如權利要求2所述引物對，或如權利要求3所述試劑盒，在鑒定南豐蜜橘品種或品系中的應用，或在華甘蜜橘育種中的應用。

6.鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，其特征在于，包括如下步驟：

7.根據權利要求6所述鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，其特征在于，步驟(3)中采用測序檢測，若基因組chr3：2131843處堿基為胞嘧啶且缺失如seq?id?no.1的核酸序列，則該待測南豐蜜橘為華甘蜜橘，反之則為其他南豐蜜橘品種或品系。

8.根據權利要求6所述鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，其特征在于，步驟(3)中采用凝膠電泳檢測，其具體操作如下：將步驟(2)所得擴增產物置于瓊脂糖凝膠中電泳分離40min；

9.根據權利要求6所述鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，其特征在于，步驟(3)中采用毛細管電泳檢測，其具體操作如下：將步驟(2)所得擴增產物置于毛細管電泳中電泳分離20min；

10.如權利要求1所述華甘蜜橘indel分子標記，或如權利要求2所述引物對，或如權利要求3所述試劑盒，或權利要求6所述鑒定南豐蜜橘品種或品系的方法，在構建南豐蜜橘指紋圖譜中的應用。

技術總結
本發明涉及分子標記輔助育種技術領域，尤其涉及華甘蜜橘InDel分子標記及引物對、應用和鑒定方法。華甘蜜橘InDel分子標記，位于南豐蜜橘基因組Chr3：2131843，其多態性為缺失/插入核酸序列；所述缺失核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述插入核酸序列的堿基為胞嘧啶。用于擴增如權利要求1所述華甘蜜橘InDel分子標記的引物對，如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。本發明可在短時間內快速、準確的鑒定南豐蜜橘化渣優系‘華甘蜜橘’，不僅降低了品種鑒定的成本，而且也為南豐蜜橘種質資源鑒定及育種利用奠定了基礎。

技術研發人員：伊華林,宋曉嬋,吳巨勛,何超,尹民強
受保護的技術使用者：華中農業大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24