本發明涉及一種合成rotundine及其衍生物的方法及全細胞催化體系的構建，屬于生物工程。

背景技術：

1、生物堿是一類自然界中廣泛存在的含氮有機化合物，目前已有超過27000個結構被報道。作為一種重要的次級代謝產物，生物堿常由于其獨特的藥理活性被人們所熟，例如，臨床手術中用于血管擴張的罌粟；強效鎮痛劑嗎啡；具有極強抑菌活性的小檗堿；用于治療急性痛風的秋水仙堿等。生物堿強大的藥理活性帶來了極大的市場潛力，但其復雜的立體化學結構是化學合成的難點，合成通常產率較低且需要重金屬催化劑的介入，這與當代綠色化學的理念相違背。因此，大多數藥用生物堿的獲取仍然依賴植物提取，但植物生長周期長，組分復雜，從中提取往往面臨著效率低、耗時長、成本高等問題，有些含量低的次生代謝產物更是難以獲取，極大地制約了相關藥物的開發和使用。隨著合成生物學的快速發展，同時為了滿足市場上藥用生物堿的巨大缺口，大腸桿菌、酵母、煙草等表達系統被廣泛用于生物堿的從頭合成，2011年研究者開發了一株工程化大腸桿菌用于高效合成芐基異喹啉生物堿的重要前體(s)-reticuline；2015年keasling團隊在酵母中進行56次基因編輯，成功實現了長春堿長達31步的異源全合成；2021年，隨著秋水仙堿植物中合成完整路徑的挖掘和報道，sattely團隊通過瞬時表達系統在煙草中實現了秋水仙堿的全合成。然而，由于生物堿結構復雜，代謝途徑冗長，涉及到的催化酶對主代謝流途徑上的生物堿中間體具有寬泛的選擇性，導致代謝流不可控、目的化合物產量低等問題；同時大部分生物堿都有毒性，高濃度的目的產物會對細胞造成毒害作用等情況，生物堿的從頭合成產量往往不能滿足市場需求。因此，多酶級聯催化，靜息細胞等策略開始受到重視。

2、左旋四氫巴馬汀，又稱左旋延胡索乙素，藥品名羅通定(rotundine)，是一種具有一個手性中心的四氫原小檗堿異喹啉生物堿，通常可以從千金藤和延胡索等中提取，是cfda批準上市的生物堿單體鎮痛制劑。天然延胡索乙素常以消旋體形式存在，其中左旋體，即左旋四氫巴馬汀(levo-tetrahydropalmatine，rotundine)，被認為是發揮藥理作用的主要成分。近年來，rotundine的藥理活性得到了廣泛的研究，特別是其鎮痛、抗成癮、抗炎、神經保護和抗癌活性。這些研究表明，rotundine是一種有前景的化合物，可以用于治療痛經、藥物成癮、炎癥性疾病、神經性疼痛、癌癥、腦水腫和急性全腦缺血再灌注損傷等。目前左旋四氫巴馬汀的主要來源仍然是植物提取，受限于其在植物中的含量極低，提取效率＜0.4‰，同時存在耗時長、成本高等問題。為了提高rotundine獲得的效率，唐培團隊在原小檗堿骨架合成中使用了全混流反應器，實現rotundine的高效合成，終產物ee值均在90％以上，收率65％左右，但重金屬催化劑ir的使用不符合綠色化學的理念。為了更高效環保的實現rotundine的合成，異源生物合成成為了研究者關注的重點，但植物中rotundine的天然合成路徑仍然是未知的，這給其天然路徑的異源重構帶來了困難。因此，smolke團隊將小檗堿類生物堿重要中間體(s)-scoulerine天然生物合成路徑與黃唐松草中挖掘到的氧甲基轉移酶tfs9omt同時重構到釀酒酵母中，基于tfs9omt的結構改造、發酵過程中的多巴胺投喂和條件優化，首次實現了rotundine的生物合成，產量達3.60μg/l；2021年，劉吉華、余伯陽團隊基于小檗堿橋酶bbe的表達優化，通過優化基因來源、表達標簽和表達載體等策略，實現了關鍵酶bbe在大腸桿菌中的活性表達，將rotundine的產量提高到1.19mg/l。最近，黃璐琦教授課題組通過代謝工程構建工程化釀酒酵母，實現了rotundine?68.6mg/l的產量，但目前生物合成的產量仍處于較低水平。

技術實現思路

1、為了解決上述技術問題，本發明設計了一條以簡單易得的苯乙酸衍生物和多巴胺為原料，利用多酶級聯反應合成rotundine及其衍生物的新路線。

2、本發明提供了一種氧甲基轉移酶突變體，所述氧甲基轉移酶突變體以氨基酸序列如seq?id?no.8所示的氧甲基轉移酶為親本，具有(a)～(c)中一個和/或多個突變：

3、(a)將親本第16位絲氨酸突變為丙氨酸或甘氨酸或亮氨酸；

4、(b)將親本第115位蘇氨酸突變為丙氨酸或甘氨酸或亮氨酸；

5、(c)將親本第301位脯氨酸突變為丙氨酸或甘氨酸或亮氨酸。

6、在一種實施方式中，所述氧甲基轉移酶突變體以氨基酸序列為seq?id?no.8所示的氧甲基轉移酶為親本；

7、將親本第16位絲氨酸突變為甘氨酸，并將親本第301位脯氨酸突變為丙氨酸；或

8、將親本第16位絲氨酸突變為甘氨酸，并將親本第301位脯氨酸突變為甘氨酸；或

9、將親本第16位絲氨酸突變為甘氨酸，第115位蘇氨酸突變為丙氨酸；或

10、將親本第16位絲氨酸突變為甘氨酸，第115位蘇氨酸突變為丙氨酸，并將親本第301位脯氨酸突變為丙氨酸。

11、本發明還提供了編碼上述氧甲基轉移酶突變體的基因。

12、本發明還提供了攜帶所述氧甲基轉移酶突變體的基因的表達載體。

13、在一種實施方式中，用于所述過表達的載體包括但不限于pet系列質粒，或prsfduet-1質粒，或pcdfduet-1質粒，或petduet-1質粒，或pacycduet-1質粒，優選為petduet-1。

14、本發明還提供了表達所述突變體，或所述基因，或攜帶上述表達載體的重組細胞。

15、在一種實施方式中，所述重組細胞以大腸桿菌escherichia?coli?bl21(de3)為底盤細胞，過表達了所述氧甲基轉移酶突變體、甲硫氨酸腺苷轉移酶(mat)和高半胱氨酸水解酶(sahh)。

16、在一種實施方式中，所述氧甲基轉移酶氨基酸序列如seq?id?no.8所示，或所述氧甲基轉移酶為上述氮甲基轉移酶突變體；所述甲硫氨酸腺苷轉移酶氨基酸序列如genbank：aan81976.1所示；所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如genbank登錄號：edl06108.1所示。

17、本發明還提供了所述氧甲基轉移酶突變體，或所述編碼上述氧甲基轉移酶突變體的基因，或所述重組細胞m4a在合成rotundine或其衍生物中的應用。

18、在一種實施方式中，大腸桿菌醇脫氫酶(yqhd、yahk、yjgb)，醛酮還原酶(dkgb、yeae、dkga)和轉錄因子(yqhc)基因敲除及構建方法參考文獻kunjapur?am,tarasova?y,prather?kl?j.synthesis?and?accumulation?of?aromatic?aldehydes?in?anengineered?strain?of?escherichia?coli[j].journal?of?the?american?chemicalsociety,2014,136(33):11644-54。

19、本發明提供了用于催化制備rotundine及其衍生物的全細胞催化劑，含有(a)～(d)的重組細胞：

20、(a)重組細胞m1a：在出發菌株iaa的基礎上表達了如下蛋白：羧酸還原酶、磷酸泛酸巰基乙胺轉移酶和去甲烏藥堿合酶；所述出發菌株為iaa，已公開于論文《modularassembly?of?an?artificially?concise?biocatalytic?cascade?for?the?manufactureof?phenethylisoquinoline?alkaloids》中；

21、(b)重組細胞m2a：以大腸桿菌bl21(de3)為底盤細胞，過表達了氧甲基轉移酶(ps6omt)、氮甲基轉移酶(cnmt)、甲硫氨酸腺苷轉移酶(mat)和高半胱氨酸水解酶(sahh)；

22、(c)重組細胞m3a：以大腸桿菌bl21(de3)為底盤細胞，過表達了小檗堿橋酶(ecbbe)、核黃素合酶(ribh)、核黃素合酶(ribc)和雙功能核黃素激酶(ribf)和分析伴侶gro7；

23、(d)重組細胞m4a：以大腸桿菌escherichia?coli?bl21(de3)為底盤細胞，過表達了所述氧甲基轉移酶突變體、甲硫氨酸腺苷轉移酶(mat)和高半胱氨酸水解酶(sahh)。

24、在一種實施方式中，所述羧酸還原酶(tpcar)的氨基酸序列如genbank：wp_013126039.1所示；所述磷酸泛酸巰基乙胺轉移酶(bssfp)的氨基酸序列如genbank：cp137756.1所示；所述去甲烏藥堿合酶(tfncs)的氨基酸序列如genbank：aco90248.13所示。

25、在一種實施方式中，所述氧甲基轉移酶(ps6omt)氨基酸序列如genbank：np_001413547.1所示；所述氮甲基轉移酶(cnmt)的氨基酸序列如genbank：bab71802.1所示；所述甲硫氨酸腺苷轉移酶氨基酸序列如genbank：aan81976.1所示；所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如genbank：edl06108.1所示。

26、在一種實施方式中，所述小檗堿橋酶(ecbbe)氨基酸序列如pdb?id：3d2d_a所示；所述核黃素合酶(ribh)的氨基酸序列如genbank登錄號：cad6020726.1所示；所述核黃素合酶(ribc)的氨基酸序列如genbank登錄號：cad6006425.1所示；所述雙功能核黃素激酶(ribf)的氨基酸序列如genbank登錄號：add75835.1所示。

27、在一種實施方式中，所述氧甲基轉移酶(t'fs9omt)氨基酸序列如pdb?id：6nej所示；所述甲硫氨酸腺苷轉移酶氨基酸序列如genbank：aan81976.1所示；所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如genbank：edl06108.1所示。

28、本發明還提供了上述重組細胞m1a～m4a在合成rotundine或其衍生物中的應用。

29、在一種實施方式中，所述應用包括：將重組細胞m1a與底物混合反應；所述底物包括苯乙酸衍生物和多巴胺。

30、在一種實施方式中，反應體系含有20-30mm抗壞血酸鹽，優選為抗壞血酸鈉。

31、在一種實施方式中，所述重組細胞(m1a、m2a、m3a或m4a)按照如下方法制備：將菌株接種至lb培養基，20-40℃培養10-12h，轉接至2yt培養基，20-40℃培養至od600值達到0.6-0.8左右，降溫至15-25℃，加入終濃度為0.05-0.5mm的iptg誘導10-20h，收集菌體。

32、在一種實施方式中，所述反應的溫度為20-40℃，所述反應的ph為7.5-8.5。

33、在一種實施方式中，所述反應的時間為6-16h，或所述反應的時間為不低于6h。

34、在一種實施方式中，所述苯乙酸衍生物的添加量為10-20mm；所述多巴胺添加量為20-30mm。

35、在一種實施方式中，所述應用包括：將所述重組細胞m1a反應后的上清液作為反應體系，將重組細胞m2a在該反應體系中進行反應；所述反應含有20-30mm抗壞血酸鹽，30-40mm多聚磷酸鹽或atp，和30-40mm?l-甲硫氨酸；所述抗壞血酸鹽優選抗壞血酸鈉；所述多聚磷酸鹽優選為atp的金屬鹽。

36、在一種實施方式中，所述反應的溫度為20-40℃，所述反應的ph為7.5-8.5。

37、在一種實施方式中，所述反應的時間為6-16h，或所述反應的時間為不低于6h。

38、在一種實施方式中，所述重組細胞m1a的添加量為50-60g/l；所述重組細胞m2a的添加量為30-120g/l，優選為80-90g/l。

39、在一種實施方式中，所述應用包括：將所述重組細胞m2a反應后的上清液作為反應體系，將重組細胞m3a在該反應體系中進行反應。

40、在一種實施方式中，所述反應的溫度為20-40℃，所述反應的ph為7.5-9.5。

41、在一種實施方式中，所述反應的時間為6-16h，或所述反應的時間為不低于6h。

42、在一種實施方式中，所述應用包括：將所述重組細胞m3a反應后的上清液作為反應體系，將重組細胞m4a在該反應體系中進行反應；所述反應體系中含有30-40mm多聚磷酸鹽或atp，和30-40mm?l-甲硫氨酸，所述多聚磷酸鹽優選為atp的金屬鹽。

43、在一種實施方式中，所述反應的溫度為20-40℃，所述反應的ph為7.5-9.5。

44、在一種實施方式中，所述反應的時間為6-16h，或所述反應的時間為不低于6h。

45、本發明還提供了一種以一鍋四步法實現體外酶級聯反應合成rotundine或其衍生物的方法。

46、在一種實施方式中，所述方法以酶為催化劑進行催化，包括以下步驟：

47、(1)第一步反應：反應體系包括：羧酸還原酶、去甲烏藥堿合酶、葡萄糖脫氫酶、多巴胺和苯乙酸或其衍生物，反應溫度為20-40℃，反應體系ph為6-8，反應時間為2-8h；

48、(2)加熱，使步驟(1)中的酶失活，收集上清；

49、(3)向步驟(2)所得上清中加入氧甲基轉移酶、氮甲基轉移酶和s-腺苷甲硫氨酸，反應溫度為20-40℃，反應時間為2-8h；

50、(4)加熱，使步驟(3)中的酶失活，收集上清；

51、(5)向步驟(4)所得上清中加小檗堿橋酶和黃素腺嘌呤二核苷酸，反應溫度為20-40℃，反應時間為2-8h；

52、(6)加熱，使步驟(5)中的酶失活，收集上清；

53、(7)向步驟(6)所得上清中加氧甲基轉移酶和s-腺苷甲硫氨酸，反應溫度為20-40℃，反應時間為2-8h，得到rotundine或其衍生物。

54、在一種實施方式中，所述步驟(1)還加入了5-10mm鎂離子、5-10mm多聚磷酸鹽或atp、1-3mm?nadp+、1-20mm葡萄糖、1-5mm抗壞血酸或抗壞血酸鹽。

55、在一種實施方式中，所述步驟(1)體系中的物質的濃度分別為：5-10μm羧酸還原酶，5-10μm去甲烏藥堿合酶，5-10μm葡萄糖脫氫酶，1-10mm底物多巴胺，1-10mm苯乙酸衍生物。

56、在一種實施方式中，所述步驟(3)中加入了5-10μm氧甲基轉移酶，5-10μm氮甲基轉移酶和5-10mm?s-腺苷甲硫氨酸。

57、在一種實施方式中，所述步驟(5)中加入了5-10μm小檗堿橋酶和5-10mm黃素腺嘌呤二核苷酸。

58、在一種實施方式中，所述步驟(7)中加入了5-10μm氧甲基轉移酶和5-10mm?s-腺苷甲硫氨酸。

59、在一種實施方式中，所述方法以表達酶的細胞為催化劑進行催化反應，所述方法包括：

60、(1)將重組細胞m1a與底物混合反應，收集反應上清液；所述底物包括苯乙酸衍生物和多巴胺；

61、(2)將重組細胞m2a與步驟(1)所得上清液混合，進行反應，收集反應上清液；

62、(3)將重組細胞m3a與步驟(2)所得上清液混合，進行反應，收集反應上清液；

63、(4)將重組細胞m4a與步驟(3)所得上清液混合，進行反應，得到rotundine或其衍生物。

64、在一種實施方式中，所述步驟(1)中反應含有20-30mm抗壞血酸鹽，優選為抗壞血酸鈉。

65、在一種實施方式中，所述步驟(2)的反應體系中含有30-40mm多聚磷酸鹽或atp，和30-40mm?l-甲硫氨酸，所述多聚磷酸鹽優選為atp的金屬鹽。

66、在一種實施方式中，所述步驟(4)的反應體系中含有30-40mm多聚磷酸鹽或atp，和30-40mm?l-甲硫氨酸，所述多聚磷酸鹽優選為atp的金屬鹽。

67、在一種實施方式中，所述反應的溫度為20-40℃，所述反應的ph為7.5-9.5。

68、在一種實施方式中，所述反應的時間為6-16h，或所述反應的時間為不低于6h。

69、在一種實施方式中，所述苯乙酸衍生物的添加量為10-20mm；所述多巴胺添加量為20-30mm。

70、在一種實施方式中，所述重組細胞m1a的添加量為50-60g/l；所述重組細胞m2a的添加量為80-90g/；所述重組細胞m3a的80-90g/l；所述重組細胞m4a的70-80g/l。

71、在一種實施方式中，所述苯乙酸衍生物的結構式如下所示：

72、

73、在一種實施方式中，所述苯乙酸或其衍生物的結構式包括1a-1g中的至少一種：

74、

75、在一種實施方式中，所述rotundine的結構式為：

76、在一種實施方式中，所述rotundine或其衍生物的結構式如下(s)-8a至(s)-8g任一所示：

77、

78、本發明還提供了所述突變體，或所述重組細胞，或所述方法在制備rotundine或其衍生物中的應用。

79、有益效果：

80、(1)本發明提供了一種氧甲基轉移酶突變體，突變體s16g/p301a相較于野生型酶，酶活力提高了19倍；突變體s16g相較于野生型酶，酶活力提高了11倍；p301a相較于野生型酶，酶活力提高了13倍；

81、(2)本發明提供了一株重組菌株m1a，該菌株可以將底物多巴胺和苯乙酸衍生物高效轉化為b芐基異喹啉骨架((s)-3a-(s)-3g，見圖1)，轉化率為95％，ee值>99％；

82、(3)本發明提供了一株重組菌株m2a，該菌株能夠利用l-甲硫氨酸和atp合成s-腺苷甲硫氨酸，同時能夠在底物(s)-3a-(s)-3g(見圖1)的6號位羥基上實現甲基化，亞氨基上實現甲基化，生成(s)-5a-(s)-5g；

83、(4)本發明提供了一株重組菌株m3a，該菌株能夠提高胞內fad的產量，同時能夠在底物(s)-5a-(s)-5g(見圖1)上實現氧化碳碳偶聯；

84、(5)本發明提供了一株重組菌株m4a，該菌株能夠利用l-甲硫氨酸和atp合成s-腺苷甲硫氨酸，同時能夠在底物(s)-6a-(s)-6g(見圖1)的2號位和9號位羥基上實現甲基化；

85、(6)本發明還提供了一種以苯乙酸衍生物和多巴胺為原料合成rotundine或其衍生物的方法，通過多酶級聯催化，或通過重組菌株進行全細胞催化，可以使rotundine的產量達到2.44g/l，(s)-8b的產量為1.01g/l。