本發明涉及mirna空間成像檢測，特別涉及crrna-spacer復合體、crispr-cas13系統、cantx傳感器及其應用。

背景技術：

1、心肌梗死（mi）是引起全世界發病和死亡的主要原因。心臟纖維化是mi后的心臟修復過程。但過度的心臟纖維化可能誘導引發不良的心臟重塑，最終導致心力衰竭。mir-208是一種位于重鏈肌球蛋白基因內含子區域的在心臟中廣泛存在的mirna，其含量的顯著升高被作為臨床診斷心臟纖維化的補充指標。mir-208還可能直接參與轉化生長因子（tgf-β）誘導的心臟成纖維細胞轉化過程，有望成為心臟纖維化預防性治療的新靶點。因此，對mirna-208在心臟成纖維細胞中的空間分布和表達水平進行直觀表征，有助于了解mir-208在心臟纖維化進程中的關鍵作用并對其進行調控，推動良性的mi心臟修復過程，降低心肌梗死患者罹患心力衰竭的風險。

2、簇狀規則穿插短回文重復序列（crispr）-cas系統因其特異性識別，剪切速度快，操作容易和易于應用的特性而廣受歡迎，其在細胞內心臟纖維化相關mirna成像研究中的發展也十分有前景。目前，crispr-cas系統已被成功用于哺乳動物中多種疾病相關基因的編輯，長鏈非編碼rna的高通量篩選，基因組位點的活細胞成像和單個mrna的熒光標記。其中具有信號放大特性的crispr-cas13系統由于具備單鏈rna靶向能力以及獨特的反式酶剪切活性，在rna編輯、體外分析和疾病分子機制研究中顯示出巨大價值。

3、然而，到目前為止，利用crispr-cas13系統來實現細胞內mirna可視化追蹤的報道仍然有限。這可能與crispr-cas13系統在細胞內可視化追蹤mirna過程中cas13蛋白活性抑制以及作為反式酶切底物的rna熒光報告子在胞內復雜環境中的不良信號泄露有關。

技術實現思路

1、本發明提供了一種crrna-spacer復合體、crispr-cas13系統、cantx傳感器及其應用。針對不同的mirna靶標序列，本發明對現有的crispr-cas13系統進行了優化，延長了crrna-spacer結構，提供了一種crrna-spacer復合體，以提高系統識別效率。基于這種crrna-spacer復合體，本發明還提供了一種本發明還提供了一種crispr-cas13系統，以及含有crispr-cas13系統和熒光報告子復合物的cantx傳感器。通過優化現有熒光報告子的繼續，并增加rep序列，優化后的cantx傳感器在生理環境中的信號泄漏顯著減少，在保留較好分析性能的同時顯著抑制了背景信號，在?mirna?可視化追蹤中表現出較高的靈敏度和較好的信噪比。本發明的技術方案具體通過以下技術實現。

2、本發明的第一方面，提供了一種crrna-spacer復合體，所述crrna-spacer復合體的核苷酸序列片段自5’端至3’端依次包括基礎片段、crrna-spacer片段以及在所述crrna-spacer的3’端連接的發夾片段；所述crrna-spacer用于引導crispr-cas13系統中的cas13蛋白識別目標mirna的靶標序列；所述基礎片段用于與cas13蛋白結合后將其負載于遞送載體表面；所述發夾片段通過自身的堿基互補配對形成發夾結構。

3、進一步地，所述基礎片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述發夾結構的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、傳統用于選定的某mirna分析的crispr-cas13系統中，所針對性設計的crrna-spacer長度為mirna的靶標序列的全互補片段。以22nt長度的mir-208為例，傳統的crrna-spacer長度也為22nt。

5、本發明通過延長crrna-spacer的3’端長度，引入了發夾結構，將原有的crrna-spacer長度（22nt）延長到35bp。在crrna-spacer的3’端連接發夾結構，能有效增強cas13的rnase（核糖核酸酶）活性，經檢測其催化常數高達107.8/min。

6、本發明提供的crrna-spacer復合體，能夠針對所有需要進行目標細胞內目標mirna可視化追蹤的情形。針對不同的目標mirna的靶標序列，只需針對性地設計調整crrna-spacer片段的序列即可，在crrna-spacer片段的3’端連接發夾結構，即都可有效增強cas13的rnase活性。

7、本發明中，基礎片段的作用是與cas13蛋白結合并將其負載于載體表面。因此，對于不同的目標細胞和不同的mirna，基礎片段可以選擇本領域已經公開或者未公開的能夠滿足上述要求的序列。

8、本發明的第二方面，提供了一種產品，包括以下任意一種：

9、（1）一種crispr-cas13系統，包括cas13蛋白和上述任意一項crrna-spacer復合體。

10、（2）一種生物材料，包括上述任意一項crrna-spacer復合體，或者包括所述crispr-cas13系統。

11、本發明提供的上述產品在發揮與傳統crispr-cas13系統相同或相似的功能和用途時，相比于現有傳統的crispr-cas13系統，cas13蛋白的rnase活性顯著提升。

12、本發明的第三方面，提供了一種cantx（crispr-cas13?based?nano-toolbox）傳感器，包括上述產品，還包括dna納米花載體和熒光報告子復合物；所述熒光報告子復合物的核苷酸序列片段自5’端至3’端依次包括rep片段和基序片段；

13、所述crispr-cas13系統和所述熒光報告子復合物加載于dna納米花載體的表面，然后原位聚合一層聚合物外殼后制備而成；所述聚合物外殼在酸性環境中降解。

14、本發明提供的上述具有內外多層結構的cantx傳感器，由dna納米花載體、熒光報告子復合物，以及經過優化的crispr-cas13系統組成。

15、熒光報告子復合物可以是目前本領域常用的uuu基序的熒光報告子，也可以是其他經過基序優化的熒光報告子。其中，dna納米花載體（dnf）作為cas13蛋白核酸復合體（rnps）的遞送載體，聚合物保護殼可以促進細胞攝取和溶酶體逃逸。

16、本發明提供的cantx傳感器在用于目標細胞內的目標mirna的原位可視化追蹤時，作用過程和作用機理具體為：cantx傳感器經由目標細胞通過胞吞作用進入細胞內部；在到達溶酶體酸性環境后，cantx傳感器最外層的聚合物外殼在酸性環境中被降解解體；進而crispr-cas13系統（主要是crrna-spacer復合體）暴露于目標細胞內環境中，并被釋放，并通過“質子海綿”效應促進它們逃出溶酶體；隨后，當目標細胞內存在目標mirna時，crrna-spacer復合體會持續性與目標細胞內的目標mirna靶標序列結合，從而激活cas13蛋白；激活后的cas13蛋白通過持續性反式切割熒光報告子，持續性產生并放大目標mirna的熒光信號強度；這些熒光信號與目標mirna存在定量關系，并可被熒光顯微鏡或熒光儀捕獲，進而反映目標細胞中目標mirna的空間位置以及含量。

17、進一步地，所述crrna-spacer復合體的核苷酸序列和所述熒光報告子復合物的核苷酸序列在所述dna納米花載體上的至少間隔5個堿基。

18、為了減少cantx傳感器在生理環境中的信號泄漏，抑制背景信號，提高在目標細胞內目標mirna可視化追蹤中的靈敏度和信噪比。進一步地，本發明對熒光報告子復合物進行了優化。將所述基序片段的核苷酸序列從廣泛使用的uuu替換為aau；在所述基序片段的3’端修飾了熒光報告子，在所述基序片段的5’端修飾了淬滅基團；所述rep片段的序列與所述dna納米花載體的序列互補。

19、可選地，rep片段的序列長度為10-15個堿基的dna片段。

20、本發明中所選用的熒光報告子可以從本領域常用的熒光報告子中任意選擇一種。

21、更進一步地，所述熒光報告子為cy5、cy5.5、cy3、alexa?fluor?532、alexa?fluor568、alexa?fluor?594、alexa?fluor?647、fam中的一種。

22、本發明在制備cantx傳感器時，所選用的聚合物保護殼材料的最終目的，是使聚合物保護殼在細胞內溶酶體的酸性環境中，被正常降解解體。因此，只要能滿足上述最終目的的聚合物保護殼材料，并滿足生物醫藥領域的安全性、毒理性等要求，就可以任意選擇并用于本發明中制備cantx傳感器。

23、進一步地，所述聚合物保護殼是將第一單體、第二單體，利用ph響應型交聯劑聚合反應形成的聚合物材料；所述第一單體為丙烯酰胺單體；所述第二單體為n-(3-氨基丙基)-甲基丙烯酰胺單體或n,n-二甲基丙烯酰胺單體或n,n-二乙基丙烯酰胺單體或n-異丙基丙烯酰胺或n,n-二丁基丙烯酰胺單體材料。

24、dna納米花載體（dnf）是基于超長鏈dna和無機金屬離子骨架的拓撲花狀納米結構。由于其可編程性、生物相容性和對分子識別刺激的特定反應的可控組裝尺寸，dnf成為生物分子檢測中強大生物傳感工具。

25、因此，可以只曉的是，本發明提供的cantx傳感器中可以選用本領域常用的dna納米花載體，例如可以采用本領域常見的制備方法自行制備dna納米花載體，也可以直接購買使用相關商品。對于某一特定目標細胞的特定目標mirna的靶標序列，設計相應的crrna-spacer，因而可以選擇本領域已知且適當的方法針對性地設計相應的dna納米花載體。

26、本發明提供的cantx傳感器，實現了crispr-cas13系統（尤其是crrna-spacer復合體）的胞內有效遞送，克服了crispr-cas13系統在胞內復雜環境中穩定性降低以及可視化追蹤過程中的信號泄露問題，實現了目標mirna高靈敏度可視化追蹤。本發明采用的cantx傳感器是一個可編程的mirna可視化傳感器，它進一步拓展了crispr/cas系統的胞內應用方向，為研究疾病的發病機制和細胞內mirna的生理功能提供了一條有前途的可行方案。

27、本發明的第四方面，提供了一種上述任意一項所述的cantx傳感器的制備方法，包括以下步驟：

28、以包含所述crrna-spacer復合體的所述基礎片段和所述rep片段在內的任意dna序列作為單鏈dna模板，制備dna納米花載體；將所述dna納米花載體與所述熒光報告子復合物在hepes緩沖液中混合，去除未結合的熒光報告子復合物，制得dnf/rep納米粒；

29、將所述crispr-cas13系統中的crrna-spacer復合體和cas13蛋白加至反應緩沖液中，混合制備成cas13蛋白核酸復合體；

30、將所述cas13蛋白核酸復合體與所述dnf/rep納米粒混合，反應，制成dnf/rep/rnps納米粒；

31、將所述dnf/rep/rnps納米粒子與制備所述聚合物外殼的聚合物單體混合攪拌均勻；加入ph響應型交聯劑（例如，二醇二甲基丙烯酸酯，egdma），攪拌均勻；

32、加入引發劑和促進劑反應，純化去除未反應的聚合物單體、ph響應型交聯劑、引發劑和促進劑，得到所述cantx傳感器。

33、可選地，上述制備方法中，所述dna納米花載體與所述熒光報告子復合物的摩爾比為1:(3-5)。

34、可選地，上述制備方法中，所述dna納米花載體與所述熒光報告子復合物的摩爾比為1:4。

35、可選地，上述制備方法中，所述丙烯酰胺、n-(3-氨基丙基)-甲基丙烯酰胺單體和ph響應型交聯劑的摩爾比為(8-10):1:(1.5-3)。

36、可選地，上述制備方法中，hepes緩沖液的配方為20mm?hepes、60mm?nacl、5mmmgcl2，ph?7.4。

37、可選地，上述制備方法中，反應緩沖液的配方為40?mm?tris-hcl、60?mm?nacl、5mm?mgcl2，ph?7.4。

38、可選地，上述制備方法中，去除未反應的n-(3-氨基丙基)-甲基丙烯酰胺單體、引發劑和促進劑的方法為：將反應產物轉移到?d-tube?dialyzer?mini（分子量截留值為5-14kda）中，并在1?×?pbs?緩沖液中透析6?h以去除未反應的單體、引發劑和促進劑。

39、本發明的第五方面，提供了一種上述任意一項所述的cantx傳感器的應用，用于待測細胞內的目標mirna的可視化追蹤。

40、與現有技術相比，本發明的有益之處在于：

41、1、本發明基于傳統crispr-cas13系統，通過延長crrna-spacer和設計熒光報告子序列，顯著提升了crispr-cas13系統的工作效率和穩定性，為crispr-cas13系統在復雜生理環境中的應用提供了新策略。

42、2、本發明構建的cantx傳感器以dnf為載體，并在外層包覆一層酸響應聚合物殼，顯著提升了cantx傳感器的體內遞送效率和溶酶體逃逸能力，為保證crispr-cas13系統的生物功能提供了良好的基礎。

43、3、本發明構建的cantx傳感器進行細胞內mirna追蹤應用中表現出了高特異性、高靈敏度以及高抗干擾能力。