本發明屬于生物，具體涉及一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體及其應用。

背景技術：

1、磷脂(phospholipids)是所有生物體生物膜的主要成分，在自然界中廣泛存在，發揮著多種多樣的作用，具有重要的生理意義。由于磷脂所具有的獨特理化性質和營養價值，磷脂在食品、保健品、醫藥及飼料等行業己經被廣泛的應用。然而，在大多數應用情況下，天然存在的磷脂要么缺乏結構多樣性，要么數量不足；因此，必須開發新方法來合成新分子或修改磷脂的自然結構。

2、酶法修飾改性是制備功能性磷脂的一個重要方向。磷脂酶a2(pla2，ec?3.1.1.4)是水解磷脂的sn-2位置的酯鍵，生成游離脂肪酸和相應的溶血磷脂。與天然卵磷脂相比，pla2制備的卵磷脂不僅表現出乳化性能增強，而且在各種工藝條件下都能形成穩定的乳劑。因此，溶血卵磷脂在食品、化妝品和制藥等工業領域有著廣泛的應用。特別是，pla2可廣泛用于酶解脫膠，這是植物油和其他食用油精制的關鍵工藝。

3、目前磷脂酶a2在工業應用中有時仍受到限制。諸如天然磷脂酶在活性、特異性和穩定性方面不滿足實際應用的需求，天然生產菌的磷脂酶產量不高等。因此獲得高產量且滿足食品安全用于功能油脂加工應用的磷脂酶迫在眉睫。通過蛋白質工程對酶進行改造是解決該問題的主要策略。

技術實現思路

1、為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體及其應用。其中，突變體n21e，q47k，f53h，y68h，i84l，q116m，n21e/i84l，q47k/i84l，i84l/q116m，n21e/i84l/q116m和q47k/i84l/q116m的酶活力均有所提高，分別提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％；本發明獲得了高酶活的磷脂酶a2突變體，具有較大的工業應用潛力和經濟價值。

2、本發明的目的通過下述技術方案實現：

3、一種紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.1經如下任意一種突變而得：

4、n21e、q47k、f53h、y68h、i84l和q116m中的至少一個；其中，n21e即第21位氨基酸由n突變為e，其他同理；

5、進一步的，紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.1經如下任意一種突變而得：

6、n21e；或q47k；或f53h；或y68h；或i84l；或q116m；或n21e/i84l；或q47k/i84l；或i84l/q116m；或n21e/i84l/q116m；或q47k/i84l/q116m。

7、編碼seq?id?no.1所示氨基酸序列的基因序列如seq?id?no.2所示。

8、一種所述紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體的編碼基因。

9、優選的，一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體n21e/i84l/q116m，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。所述突變體的第21位，84位氨基酸和第116位氨基酸分別由天冬酰胺n、異亮氨酸i和谷氨酰胺q突變為谷氨酸e、亮氨酸l和甲硫氨酸m。

10、一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體n21e/i84l/q116m的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

11、上述突變體相關的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

12、(a)含有上述編碼基因的表達盒；

13、(b)含有上述編碼基因的重組表達載體；

14、(c)含有(a)中所述表達盒的重組表達載體；

15、(d)含有上述編碼基因的重組微生物；

16、(e)含有(a)中所述表達盒的重組微生物；

17、(f)含有(b)或(c)中所述重組表達載體的重組微生物。

18、進一步的，(a)中所述表達盒使用的表達元件是：p43和pgntk雙啟動子，apre信號肽和ter終止子。

19、所述pgntk啟動子的序列如seq?id?no.5中的第1-182bp所示。

20、所述apre信號肽來源于枯草芽孢桿菌，其氨基酸序列如genbank號：wp_015383267.1中的1-29aa所示；編碼apre信號肽的基因序列如seq?id?no.5中的第183-269bp所示。

21、進一步的，(b)、(c)中所述重組表達載體的出發載體為pbe系列的載體等；優選為pbe2-r載體、含有p43和pgntk雙啟動子的pbe載體等。

22、進一步的，(d)、(e)、(f)中所述重組微生物對應的宿主微生物選自原核生物或酵母等；所述原核生物包括芽孢桿菌屬(bacillus)等細菌；所述酵母包括畢赤酵母等酵母。更具體而言，所述原核生物是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)，具體可為枯草芽孢桿菌atcc6051和解淀粉芽孢桿菌lb1ba02；所述酵母是畢赤酵母gs115。

23、上述突變體、編碼基因或突變體相關的生物材料在制備高酶活的磷脂酶a2突變體中的應用。

24、上述突變體、編碼基因或突變體相關的生物材料在生產功能磷脂中的應用。

25、進一步的，上述突變體、編碼基因或突變體相關的生物材料應用于保健品、食品、醫藥、日化等領域和油脂精煉中。

26、一種獲得上述突變體的方法，包括如下步驟：通過設計含有突變位點的引物對編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2的基因進行定點突變后表達，得到紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體。

27、進一步的，設計含有突變位點的引物向編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2的基因中引入突變，經測序正確后轉化至枯草芽孢桿菌atcc6051中進行表達，得到紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體。

28、本發明具體實施步驟如下：

29、1.構建磷脂酶a2突變體重組表達載體：1)將經密碼子優化后合成的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2野生型基因和來源于枯草芽孢桿菌的apre信號肽連接至含有p43和pgntk雙啟動子的pbe載體上，構建表達質粒pbe-p43-pgntk-apre-svpla2wt；2)通過重疊pcr擴增定點突變野生磷脂酶a2，獲得相應的磷脂酶a2突變體表達質粒。

30、2.構建磷脂酶a2突變體重組工程菌及以此制備高酶活的磷脂酶a2：將磷脂酶a2突變體表達質粒轉化至枯草芽孢桿菌atcc6051中，得到重組工程菌；之后經發酵得到磷脂酶a2突變體。

31、3.磷脂酶a2突變體酶學性質的表征：以2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿為底物，使用微孔比色法測定突變體的酶學性質。

32、本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

33、本發明共獲得了11個酶活力提高的突變體，包括6個單位點突變的突變體及5個組合突變體；相較于野生型，突變體n21e，q47k，f53h，y68h，i84l，q116m，n21e/i84l，q47k/i84l，i84l/q116m，n21e/i84l/q116m和q47k/i84l/q116m的酶活力均有所提高，分別提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％。本發明獲得的突變體酶活力得到顯著提高，磷脂酶a2酶活力提升進一步提升了該酶的工業利用價值。