本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)，尤其是涉及一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨類器官是一種模擬真實(shí)骨骼結(jié)構(gòu)和功能的微型組織，骨類器官模仿了自然骨骼的分層結(jié)構(gòu)，包括骨松質(zhì)、骨密質(zhì)和骨髓等不同層次。這種結(jié)構(gòu)保證了骨類器官在力學(xué)和生物學(xué)特性上與真實(shí)骨骼相似。骨類器官主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等組成。成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨骼的形成和修復(fù)，破骨細(xì)胞則參與骨骼的吸收和重塑。骨細(xì)胞則嵌入在骨骼基質(zhì)中，維持骨骼的穩(wěn)定性和功能。骨髓細(xì)胞包括多種類型的干細(xì)胞，它們可以分化為各種細(xì)胞類型，參與骨代謝和修復(fù)。

2、骨類器官的局部微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)、血管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞因子等。細(xì)胞外基質(zhì)提供了細(xì)胞附著的支架，同時(shí)含有多種生物活性分子，如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，這些分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為和功能。血管網(wǎng)絡(luò)則負(fù)責(zé)為骨類器官提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)清除代謝廢物。

3、骨代謝的復(fù)雜性體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：骨代謝涉及多種細(xì)胞類型的相互作用，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等，它們?cè)诠趋赖纳L(zhǎng)、重塑和修復(fù)過(guò)程中相互協(xié)作；骨骼在生理狀態(tài)下需要保持動(dòng)態(tài)平衡，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)必須精確協(xié)調(diào)，以維持骨骼的結(jié)構(gòu)和功能；骨骼不僅需要承受機(jī)械負(fù)荷，還受到遺傳、激素、營(yíng)養(yǎng)和生活方式等多種生物學(xué)因素的影響，這些因素共同影響骨代謝的過(guò)程；骨代謝受到局部微環(huán)境和全身調(diào)節(jié)系統(tǒng)的共同控制，如內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。

4、目前，對(duì)成骨礦化類器官的研究，提供一種具備破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備至關(guān)重要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官及其制備與應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，包括以下步驟：

4、(s1)將骨髓原代細(xì)胞培養(yǎng)后收集單核細(xì)胞，含有m-csf的培養(yǎng)基，貼壁后擴(kuò)增得到破骨前體細(xì)胞；

5、(s2)將步驟(s1)制備得到的破骨前體細(xì)胞與具備自主礦化能力的骨類器官混勻后加入低粘附板，然后置于含m-csf的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到骨小梁類器官；

6、(s3)將步驟(s2)制備得到的骨小梁類器官利用含有rankl和m-csf的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)處理，得到具有破骨代謝活性的骨小梁類器官。

7、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(s1)中，含有m-csf的培養(yǎng)基中，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

8、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(s1)中，破骨前體細(xì)胞、具備自主礦化能力的骨類器官、含m-csf的培養(yǎng)基的用量比為5×104～5個(gè)細(xì)胞：1個(gè)：100μl。

9、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，具備自主礦化能力的骨類器官通過(guò)下述方法制備得到：

10、(a1)將matrigel基質(zhì)膠與collagen?i工作溶液混勻，得到類器官基質(zhì)工作液；

11、(a2)成骨前體細(xì)胞細(xì)胞系懸于步驟(a1)制備得到的類器官基質(zhì)工作液中并置于pdms芯片中，凝固后利用含有10％?fbs的α-mem培養(yǎng)液進(jìn)行浸泡處理，得到骨類器官；

12、(a3)將步驟(a2)制備得到的骨類器官利用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)處理，得到具有自主礦化能力的骨類器官。

13、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，含m-csf的培養(yǎng)基中，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

14、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(s3)中，含有rankl和m-csf的培養(yǎng)基中，rankl的濃度為30～60ng/ml，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

15、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(s3)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，溫度為37℃，5％co2，時(shí)間1～35天。

16、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官，通過(guò)上述方法制備得到。

17、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官在破骨-成骨互作研究、藥物篩選或靶點(diǎn)驗(yàn)證中的應(yīng)用。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

19、(1)基于礦化后骨類器官，接種原代骨髓單核細(xì)胞，并可以分化成為具有特征性結(jié)構(gòu)的破骨細(xì)胞，形成具備破骨代謝活性的骨小梁類器官。

20、(2)再現(xiàn)體內(nèi)骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的空間位置與結(jié)構(gòu)，并可以分化成為具有特征性結(jié)構(gòu)的破骨細(xì)胞，仿生體內(nèi)骨小梁生理結(jié)構(gòu)。

21、(3)首創(chuàng)結(jié)合成骨代謝與破骨代謝為一體的骨類器官，可用于研究成骨-破骨互作，藥物篩選，靶點(diǎn)驗(yàn)證等。

技術(shù)特征：

1.一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，步驟(s1)中，含有m-csf的培養(yǎng)基中，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，步驟(s1)中，破骨前體細(xì)胞、具備自主礦化能力的骨類器官、含m-csf的培養(yǎng)基的用量比為5×104～5個(gè)細(xì)胞：1個(gè)：100μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，具備自主礦化能力的骨類器官通過(guò)下述方法制備得到：

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，含m-csf的培養(yǎng)基中，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，步驟(s3)中，含有rankl和m-csf的培養(yǎng)基中，rankl的濃度為30～60ng/ml，m-csf的濃度為30～60ng/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，含有rankl和m-csf的培養(yǎng)基中，rankl的濃度為50ng/ml，m-csf的濃度為50ng/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官的制備方法，其特征在于，步驟(s3)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，溫度為37℃，5％co2，時(shí)間1～35天。

9.一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求1～8任一所述方法制備得到。

10.一種如權(quán)利要求9所述的具有破骨代謝活性的骨小梁類器官在破骨-成骨互作研究、藥物篩選或靶點(diǎn)驗(yàn)證中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種具有破骨代謝活性的骨小梁類器官及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明首先將骨髓原代細(xì)胞培養(yǎng)后收集單核細(xì)胞，含有M?CSF的培養(yǎng)基，貼壁后擴(kuò)增得到破骨前體細(xì)胞；然后將破骨前體細(xì)胞與具備自主礦化能力的骨類器官混勻后加入低粘附板，然后置于含M?CSF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到骨小梁類器官；最后將骨小梁類器官利用含有RANKL和M?CSF的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)處理，得到具有破骨代謝活性的骨小梁類器官。本發(fā)明制備得到的具有破骨代謝活性的骨小梁類器官可進(jìn)一步應(yīng)用于破骨?成骨互作研究、藥物篩選或靶點(diǎn)驗(yàn)證中。

技術(shù)研發(fā)人員：劉月華,童顯琴,李遠(yuǎn)遠(yuǎn),李嬌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海市口腔醫(yī)院（上海市口腔健康中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28