本發明涉及生物，具體涉及nodu基因在調控莖瘤固氮根瘤菌結瘤能力和固氮效率中的應用。

背景技術：

1、根瘤菌是一類能與豆科植物建立起共生固氮關系的革蘭氏陰性細菌。在自然生態系統中，根瘤菌與豆科植物的共生固氮有助于提升土壤肥力。通過固氮作用，豆科植物能夠將大氣中的氮氣轉化為植物可利用的氮化合物，從而顯著拓展植物對氮素的利用能力。根瘤菌和豆類之間發生的結瘤過程主要是由結瘤因子引起的。結瘤因子是根瘤發育和細胞內感染根部所需的脂殼聚糖寡聚體，在極低濃度下具有活性。負責結瘤因子生物合成的酶由nod、noe和nol等基因編碼，它們位于共生質粒或基因組島中。合成具有活性的結瘤因子一般需要多個結瘤因子基因的參與，在多種基因及底物的配合下，根瘤菌合成具有生物活性的結瘤因子，并與宿主結瘤共生。

2、莖瘤固氮根瘤菌(azorhizobium?caulinodans)ors571是一種較為特殊的根瘤菌，其具備共生及自生固氮能力，不僅能夠在寄主植物毛萼田菁的根部結瘤，也能在其莖部結瘤。這種特殊的固氮能力使其能夠促進毛萼田菁的生長，并提升毛萼田菁對鹽堿環境的適應能力。根據生物信息學分析發現，莖瘤固氮根瘤菌ors571共生固氮功能來源于后天遺傳進化，共生島可能是通過水平轉移方式整合到基因組。該共生島主要是結瘤基因簇，不含fix和nif基因，結瘤基因簇長度87.6kb，克隆存在較大難度。目前還未見有基于單一的nodu基因實現同時調控莖瘤固氮根瘤菌ors571結瘤和固氮能力的報道。

技術實現思路

1、針對上述現有技術，本發明的目的是提供nodu基因在調控莖瘤固氮根瘤菌結瘤能力和固氮效率中的應用。本發明研究發現，在莖瘤固氮根瘤菌中過表達nodu基因，能同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤和固氮能力。

2、為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

3、本發明的第一方面，提供nodu基因在如下(1)或(2)中的應用：

4、(1)同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤能力和固氮能力；

5、(2)促進根瘤菌和植物之間的共生效應；

6、所述nodu基因是如下i)或ii)所示的dna分子：

7、i)核苷酸序列是seq?id?no.1所示的dna分子；

8、ii)除i)以外的編碼seq?id?no.2所示氨基酸序列的dna分子。

9、上述應用中，所述促進根瘤菌和植物之間的共生效應包括：增加結瘤數量、提升固氮能力和/或促進植物生長。

10、nodu基因編碼氨基甲酰轉移酶(carbamoyltransferase)，本發明研究發現，在莖瘤固氮根瘤菌ors571過表達單一nodu基因，就能同時提高莖瘤固氮根瘤菌ors571的結瘤能力和固氮能力。將過表達nodu基因的莖瘤固氮根瘤菌ors571接種豆科植物進行共生，能夠明顯增加豆科植物的結瘤數量、提升固氮能力和促進豆科植物的生長。

11、本發明的第二方面，提供nodu基因編碼的蛋白在如下(1)或(2)中的應用：

12、(1)同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤能力和固氮能力；

13、(2)促進根瘤菌和植物之間的共生效應。

14、上述應用中，所述nodu基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

15、蛋白是基因功能的具體執行者和體現者，因此，nodu基因編碼的蛋白在同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤能力和固氮能力，以及促進根瘤菌和植物之間的共生效應中的應用，也是本發明的保護范圍。

16、本發明的第三方面，提供含有nodu基因的表達盒或重組表達載體在如下(1)-(3)任一項中的應用：

17、(1)構建過表達nodu基因的重組根瘤菌；

18、(2)同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤能力和固氮能力；

19、(3)促進根瘤菌和植物之間的共生效應。

20、作為優選，含有nodu基因的表達盒的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；由nodu基因上游序列(438bp)(seq?id?no.3的第1-438位)、編碼nodu基因的序列(1683bp)(seq?idno.3的第439-2121位)和nodu基因下游序列(432bp)(seq?id?no.3的第2122-2553位)組成。

21、作為優選，構建重組表達載體所使用的基礎質粒為pbbr1mcs-2質粒(序列見https://www.addgene.org/85168/sequences/)，它是能夠把外源dna或目的基因運載進入宿主細胞進行擴增和表達的載體。

22、本發明的第四方面，提供一種過表達nodu基因的重組根瘤菌，由如下方法制備而成：

23、將seq?id?no.3所示的含有nodu基因的表達盒連入pbbr1mcs-2質粒中，構建得到重組質粒pbbr1mcs-2-nodu；

24、將重組質粒pbbr1mcs-2-nodu導入到莖瘤固氮根瘤菌ors571中，制備得到過表達nodu基因的重組根瘤菌。

25、本發明的第五方面，提供上述過表達nodu基因的重組根瘤菌在促進植物結瘤及生長中的應用。

26、上述應用中，所述植物為毛萼田菁。

27、本發明的第六方面，提供一種促進毛萼田菁在低氮條件下結瘤和生長的方法，包括以下步驟：

28、將過表達nodu基因的重組根瘤菌作為接種劑浸泡發芽的毛萼田菁種子3h后，將種子轉移至滅菌的拌有低氮營養液的蛭石中，于25℃，光照周期12h：12h條件下培養，促進毛萼田菁的結瘤和生長。

29、本發明的有益效果：

30、本發明構建莖瘤固氮根瘤菌ors571結瘤基因nodu過表達菌株，其接種豆科植物進行共生，與接種野生型根瘤菌的豆科植物相比，能夠明顯增加豆科植物的結瘤數量，提高結瘤的固氮能力及提升植株生長表型，統計學分析具有顯著差異。通過本發明構建的基因工程重組根瘤菌在寄主毛萼田菁的根部與莖部結瘤能力更強，多于未經改造的野生型根瘤菌，且其結瘤的固氮能力顯著提升，定殖后對寄主植物的促生能力更強。

技術特征：

1.nodu基因在如下(1)或(2)中的應用：

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述促進根瘤菌和植物之間的共生效應包括：增加結瘤數量、提升固氮能力和/或促進植物生長。

3.權利要求1所述的nodu基因編碼的蛋白在如下(1)或(2)中的應用：

4.含有nodu基因的表達盒或重組表達載體在如下(1)-(3)任一項中的應用：

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，含有nodu基因的表達盒的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，構建重組表達載體所使用的基礎質粒為pbbr1mcs-2質粒。

7.一種過表達nodu基因的重組根瘤菌，其特征在于，由如下方法制備而成：

8.權利要求7所述的過表達nodu基因的重組根瘤菌在促進植物結瘤及生長中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述植物為毛萼田菁。

10.一種促進毛萼田菁在低氮條件下結瘤和生長的方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術總結
本發明公開了nodU基因在調控莖瘤固氮根瘤菌結瘤能力和固氮效率中的應用，屬于生物技術領域。本發明研究發現，在莖瘤固氮根瘤菌中過表達nodU基因，能同時提高莖瘤固氮根瘤菌的結瘤和固氮能力。本發明構建莖瘤固氮根瘤菌ORS571結瘤基因nodU過表達菌株，其接種豆科植物進行共生，與接種野生型根瘤菌的豆科植物相比，能夠明顯增加豆科植物的結瘤數量，提高結瘤的固氮能力及提升植株生長表型。

技術研發人員：解志紅,周亞男,孫麗,王丹丹,王帥兵,畢文潔
受保護的技術使用者：山東農業大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28