本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種融合蛋白ifnα-ge-fc及其在制備重組水痘-帶狀皰疹重疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster?virus,?vzv）是人類皰疹病毒屬α皰疹病毒科成員，是一種包膜病毒，具有高度種屬特異性，其自然感染僅僅發(fā)生于人與大猩猩。vzv基因組是線性雙鏈dna分子，至少編碼了71個開放閱讀框，線性vzv基因組被蛋白衣殼所包被，殼外有脂蛋白含量豐富的包膜，包膜上存在9種糖蛋白，分別為gb、gc、ge、gh、gi、gk、gl、gm和gn，這些糖蛋白在病毒的復制與包裝方面發(fā)揮著重要的作用。其中g(shù)e由orf68編碼，含623個氨基酸（aminoacid，aa）,為i型跨膜蛋白，可分為胞外區(qū)（1～538）、跨膜區(qū)（539～559）和胞內(nèi)區(qū)（560～623），ge是病毒包膜及感染細胞中含量最豐富的蛋白，與病毒的感染、致病性密切相關(guān)，并且具有很強的免疫原性，在原發(fā)感染和潛伏再激活感染期間均能誘導機體產(chǎn)生很強的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。vzv原發(fā)感染時通過呼吸道黏膜進入體內(nèi)引起水痘，水痘痊愈后，病毒潛伏在神經(jīng)節(jié)，當機體抵抗力降低時，vzv被重新激活并引發(fā)帶狀皰疹，患者可有明顯疼痛和不適，癥狀可持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，導致生活質(zhì)量下降。最常見的嚴重并發(fā)癥是帶狀皰疹后神經(jīng)痛,在帶狀皰疹患者中發(fā)生率為10%-30%,疼痛可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前，接種疫苗是預(yù)防帶狀皰疹、減輕疾病負擔的主要措施。

2、鑒于vzv的ge糖蛋白具有很強的免疫原性，而且其抗原表位相當保守，是比較合適的亞單位疫苗候選抗原。gsk公司開發(fā)的帶狀皰疹亞單位疫苗shingrix就是基于重組ge蛋白輔以新型佐劑as01b，能顯著增強細胞免疫應(yīng)答；臨床研究表明，該亞單位疫苗可顯著降低老年人罹患帶狀皰疹的風險，并且能有效降低隨后的帶狀皰疹后神經(jīng)痛風險，說明重組亞單位疫苗可有效預(yù)防帶狀皰疹的發(fā)生，已于2017年在美國上市，2020年在中國上市。shingrix中使用的佐劑as01b是一種強力的新型佐劑，在顯著增強細胞免疫的同時，疫苗副作用也更加明顯；其次，as01b中主要的成分之一qs21是提取自皂樹種的天然成分，人工合成成本較高，也面臨短期供應(yīng)不足等問題。

3、因此迫切需要研制具有自主產(chǎn)權(quán)、安全有效的疫苗，新的帶狀皰疹疫苗可立足于亞單位疫苗，需要開發(fā)能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫的新型佐劑，或者能刺激產(chǎn)生更強烈免疫應(yīng)答的抗原，以獲得理想的免疫效果。本發(fā)明致力于通過對抗原ge的合理設(shè)計，改善傳統(tǒng)佐劑的不足，降低對強力佐劑的依賴性，進而減少疫苗接種的不良反應(yīng)。

4、i型干擾素是一種由不同細胞分泌產(chǎn)生的具有多種生物活性的蛋白質(zhì)，是重要的抗病毒細胞因子，同時還有免疫調(diào)節(jié)作用。ifnα可強有力地促進抗原呈遞和激活適應(yīng)性免疫，其發(fā)揮作用的主要細胞群為樹突狀細胞dc細胞，作用于未成熟的dc細胞后，通過促進dc細胞表面的各種共刺激分子、趨化因子受體和mhc分子的表達，刺激dc細胞活化，進而激活t細胞。越來越多的研究表明ifnα可作為免疫佐劑分子來使用，其生物學作用有一定的種屬特異性，在先天免疫和適應(yīng)性免疫的過渡中發(fā)揮重要作用，可進一步增強疫苗的活性和效價，目前已經(jīng)用于新型冠狀病毒重組亞單位疫苗。

5、將抗原與fc段融合連接，可極大地延長抗原的半衰期，fc受體在許多先天免疫細胞表面都有表達，fc融合蛋白可與apc細胞表面表達的fc受體結(jié)合，從而促進apc對抗原的呈遞與加工。目前，已有多種人igg-fc融合蛋白藥物經(jīng)fda批準臨床使用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明構(gòu)建了一種ifnα-ge-fc融合蛋白，其中g(shù)e通過人igg的fc段二聚化，可以增加蛋白穩(wěn)定性和大小，以促進有效的ln靶向和樹突狀細胞捕獲，同時提高了純化效率。為了進一步增加dcs對抗原的處理和提呈，在ge-fc的n端融合細胞因子ifnα以同時誘導強烈的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫，又未引入任何外源序列，可有效增強細胞免疫反應(yīng)，改善傳統(tǒng)佐劑的不足，為開發(fā)安全有效的水痘或帶狀皰疹疫苗提供候選疫苗。

2、本發(fā)明提供一種融合蛋白ifnα-ge-fc，其特征在于，包括干擾素α、vzv糖蛋白ge和人igg1fc結(jié)構(gòu)域，其中，ifnα可來自人源或鼠源，優(yōu)選為小鼠ifn-α4、人ifn-α2，具體地其氨基酸序列如seq?id?no：1或seq?id?no：2所示；vzv糖蛋白ge優(yōu)選為其胞外結(jié)構(gòu)域，具體為第31~538位氨基酸，如seq?id?no：3所示；人igg1fc結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為ch2-ch3；

3、其中，將干擾素α連接至vzv糖蛋白ge胞外段的n端，人igg1fc結(jié)構(gòu)域連接至vzv糖蛋白ge胞外段的c端，直接串聯(lián)連接，得到融合蛋白ifnα-ge-fc

4、進一步，還連接了il-10的信號肽，具體的其氨基酸序列如seq?id?no：5所示。

5、具體地，所述免疫球蛋白fc片段選自于人、小鼠、兔子、牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、或豚鼠的免疫球蛋白fc片段；進一步地，所述免疫球蛋白fc片段選自igg、iga、igd、ige或igm的fc片段；其中優(yōu)選地，所述免疫球蛋白fc片段選自igg1?fc片段、igg2?fc片段、igg3?fc片段、或igg4?fc片段；尤其優(yōu)選地，所述免疫球蛋白fc片段是人igg?fc片段，最優(yōu)選地是如seq?id?no.4所示的氨基酸序列。

6、優(yōu)選地，所述融合蛋白包含seq?id?no.6，seq?id?no.7所示的氨基酸序列。

7、本發(fā)明提供所述的融合蛋白的編碼核酸；

8、優(yōu)選地，所述小鼠ifn-α4的核酸編碼序列如seq?id?no：8所示或其簡并序列；所述人ifn-α2的核酸編碼序列如seq?id?no：9所示或其簡并序列；所述ge胞外段的核酸編碼序列如seq?id?no：10所示或其簡并序列；免疫球蛋白fc片段核酸編碼序列如seq?id?no：11所示或其簡并序列；

9、更優(yōu)選地，將序列根據(jù)哺乳動物細胞表達偏好進行了密碼子優(yōu)化。

10、優(yōu)選地，其核苷酸序列如seq?id?no：12，seq?id?no：13所示或其簡并序列。

11、本發(fā)明提供所述的編碼核酸的重組載體、重組細胞。

12、本發(fā)明還提供所述的融合蛋白ifnα-ge-fc在制備水痘重組亞單位疫苗或帶狀皰疹重組亞單位疫苗中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明進一步提供一種水痘重組亞單位疫苗或帶狀皰疹重組亞單位疫苗，其包含權(quán)利要求1-4任一項所述的融合蛋白ifnα-ge-fc；不包括佐劑或包括佐劑，具體為alum佐劑、mnj佐劑、as01b佐劑。具體地，所述融合蛋白通過化學合成，或基因重組方法獲得。

14、本發(fā)明構(gòu)建的ifnα-ge-fc融合蛋白在小鼠免疫實驗中，與ge原型相比較，在無外源性佐劑或使用alum佐劑時，其都可誘導產(chǎn)生更高水平的ge結(jié)合抗體、中和抗體及細胞免疫；在使用mnj佐劑時，ifnα-ge-fc與ge均能誘導產(chǎn)生高水平的中和抗體，但ifnα-ge-fc誘導產(chǎn)生的細胞免疫更強；在使用as01b佐劑時，ifnα-ge-fc可誘導產(chǎn)生更高水平的中和抗體，但細胞免疫水平弱于as01b/ge，說明了融合蛋白免疫原在誘導vzv特異性免疫應(yīng)答的效果顯著，而這改善了ge免疫原性較弱以及傳統(tǒng)佐劑的不足，為開發(fā)安全有效的水痘或帶狀皰疹疫苗提供了候選疫苗。