本發(fā)明涉及栝樓抗性新品種培育，具體為一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法。
背景技術(shù)：
1、栝樓作為一種重要的藥食同源植物，在傳統(tǒng)中藥和保健食品領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，栝樓的果實、種子、根和藤均含有豐富的活性成分，如三萜類、黃酮類和多糖類化合物，具有清熱化痰、潤肺止咳、通絡(luò)消腫等藥理作用，因此在醫(yī)藥和功能性食品開發(fā)中備受關(guān)注。
2、然而，栝樓種植過程中常面臨病蟲害的嚴重威脅，特別是蔓枯病、根結(jié)線蟲和炭疽病等病害，這些病害不僅導(dǎo)致栝樓產(chǎn)量顯著下降，還顯著影響其質(zhì)量和經(jīng)濟效益，傳統(tǒng)的病害防控措施主要依賴化學(xué)農(nóng)藥和輪作等方式，但這些方法存在藥物殘留、環(huán)境污染及病原菌抗藥性等諸多問題。因此，開發(fā)具有優(yōu)異抗病性的栝樓新品種，成為提升栝樓種植效益的關(guān)鍵途徑之一。
3、隨著分子育種技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、基因編輯及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種的前沿手段，這些技術(shù)能夠精準挖掘與抗病性相關(guān)的關(guān)鍵基因，并通過分子手段快速實現(xiàn)性狀改良，相較于傳統(tǒng)育種方式具有顯著的效率和精確性優(yōu)勢，然而，目前在栝樓抗性育種領(lǐng)域，基于分子育種技術(shù)的研究和應(yīng)用尚處于起步階段，缺乏針對性強且具有實用價值的技術(shù)解決方案。
4、本發(fā)明通過利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘栝樓抗病相關(guān)的差異表達基因，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)及分子標記篩選方法，提出了一種系統(tǒng)、有效的栝樓抗性新品種培育方法，本發(fā)明不僅解決了傳統(tǒng)育種周期長、效率低的問題，還為栝樓抗性育種提供了一種高效的技術(shù)路徑，從而推動栝樓品種改良及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、(一)解決的技術(shù)問題
2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法。
3、(二)技術(shù)方案
4、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：包括以下步驟：
5、(s1)篩選栝樓抗性基因，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，挖掘與栝樓抗病性相關(guān)的差異表達基因；
6、(s2)構(gòu)建抗性基因的過表達載體，通過同源重組法將抗性基因插入到帶有標記基因的植物表達載體中；
7、(s3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化栝樓愈傷組織，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因陽性植株；
8、(s4)對陽性植株進行病害接種試驗，篩選抗性顯著的植株；
9、(s5)將篩選出的抗性植株通過雜交育種方式進行繁殖，獲得具有穩(wěn)定遺傳的抗性新品種。
10、優(yōu)選的，所述步驟(s1)中的轉(zhuǎn)錄組測序使用dnbseq平臺完成，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制后，采用david數(shù)據(jù)庫進行g(shù)o功能富集分析和kegg?pathway富集分析，確定與抗病相關(guān)的候選基因。
11、優(yōu)選的，所述步驟(s2)中的過表達載體構(gòu)建采用pmdc202載體，該載體帶有mgfp標簽，用于篩選陽性植株；通過pcr擴增抗性基因的cds區(qū)域，并利用同源重組技術(shù)將其插入到載體的多克隆位點中。
12、優(yōu)選的，所述步驟(s3)中利用農(nóng)桿菌侵染栝樓愈傷組織，侵染后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基上進行篩選，直至獲得抗性陽性植株。
13、優(yōu)選的，所述步驟(s4)中的病害接種試驗包括：
14、(s41)分別接種蔓枯病菌、根結(jié)線蟲和炭疽病菌；
15、(s42)觀察病害發(fā)生情況并記錄抗性評分；
16、(s43)利用qrt-pcr技術(shù)檢測抗性基因的表達量，驗證其與抗病性相關(guān)性。
17、優(yōu)選的，所述步驟(s5)中的雜交育種方式包括以下過程：
18、(s51)將篩選出的抗性植株作為親本，人工授粉獲得f1代；
19、(s52)對f1代植株進行抗病篩選，挑選抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的植株；
20、(s53)將抗性穩(wěn)定的植株進一步雜交，直至獲得f2代抗性新品種。
21、優(yōu)選的，轉(zhuǎn)基因栝樓陽性植株的抗性驗證包括利用熒光顯微鏡檢測mgfp標簽的表達情況，結(jié)合pcr技術(shù)驗證抗性基因的整合。
22、優(yōu)選的，對獲得的栝樓抗性新品種進行田間試驗，包括：
23、(a)在多個適生地區(qū)種植栝樓抗性新品種，對其抗病性、產(chǎn)量和品質(zhì)進行對比研究；
24、(b)對照品種選擇為當?shù)爻Ｒ婅闃瞧贩N，記錄生長周期、病害發(fā)生情況及經(jīng)濟性狀數(shù)據(jù)；
25、(c)應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法對試驗結(jié)果進行顯著性檢測，評價新品種的綜合表現(xiàn)。
26、優(yōu)選的，通過染色質(zhì)免疫沉淀測序法(chip-seq)和凝膠阻滯實驗，進一步驗證抗性關(guān)鍵基因與其下游靶基因的相互作用。
27、(三)有益的技術(shù)效果
28、(1)提高栝樓抗病能力：通過利用分子育種技術(shù)，本發(fā)明精準篩選并引入與栝樓抗病性密切相關(guān)的基因，顯著增強了栝樓對蔓枯病、根結(jié)線蟲和炭疽病等病害的抗性，減少了病害對栝樓生長和產(chǎn)量的負面影響。
29、(2)加速育種過程：本發(fā)明結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組測序、基因編輯、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等現(xiàn)代育種手段，相較于傳統(tǒng)的雜交育種方法，顯著縮短了新品種培育周期，提高了育種效率。
30、(3)保證抗性遺傳的穩(wěn)定性：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的抗性植株，在多代繁殖后仍能保持穩(wěn)定的抗性性狀，確保了新品種在大規(guī)模種植時的可靠性和一致性。
31、(4)提升栝樓種植效益：抗性新品種在田間試驗中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病性和產(chǎn)量優(yōu)勢，有效減少了農(nóng)藥使用，降低了生產(chǎn)成本，同時提高了栝樓的品質(zhì)和市場競爭力，為種植者帶來了顯著的經(jīng)濟效益。
32、(5)減少環(huán)境污染：通過減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，本發(fā)明對環(huán)境友好，有助于實現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展，符合綠色種植和生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。
33、(6)推動栝樓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展：本發(fā)明為栝樓抗病育種提供了系統(tǒng)化、科學(xué)化的技術(shù)路徑，填補了栝樓分子育種領(lǐng)域的技術(shù)空白，為栝樓品種改良和規(guī)?；茝V提供了技術(shù)支撐，推動了栝樓相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
1.一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，所述步驟(s1)中的轉(zhuǎn)錄組測序使用dnbseq平臺完成，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制后，采用david數(shù)據(jù)庫進行g(shù)o功能富集分析和kegg?pathway富集分析，確定與抗病相關(guān)的候選基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，所述步驟(s2)中的過表達載體構(gòu)建采用pmdc202載體，該載體帶有mgfp標簽，用于篩選陽性植株；通過pcr擴增抗性基因的cds區(qū)域，并利用同源重組技術(shù)將其插入到載體的多克隆位點中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，所述步驟(s3)中利用農(nóng)桿菌侵染栝樓愈傷組織，侵染后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基上進行篩選，直至獲得抗性陽性植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，所述步驟(s4)中的病害接種試驗包括：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，所述步驟(s5)中的雜交育種方式包括以下過程：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，轉(zhuǎn)基因栝樓陽性植株的抗性驗證包括利用熒光顯微鏡檢測mgfp標簽的表達情況，結(jié)合pcr技術(shù)驗證抗性基因的整合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，對獲得的栝樓抗性新品種進行田間試驗，包括：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子育種技術(shù)的栝樓抗性新品種培育方法，其特征在于，通過染色質(zhì)免疫沉淀測序法(chip-seq)和凝膠阻滯實驗，進一步驗證抗性關(guān)鍵基因與其下游靶基因的相互作用。