本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，尤其涉及一種基于微流控的睪丸器官芯片及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前在探索生殖損傷因素對于男性生育力影響的一系列研究技術(shù)存在多種研究平臺，主要包含三類：動物模型、睪丸細(xì)胞培養(yǎng)、睪丸類器官培養(yǎng)。但上述研究平臺在研究生殖藥理學(xué)、生殖毒理學(xué)方面均有缺陷。

2、動物模型：目前動物模型主要包括小鼠、大鼠、牛等，此模型研究過程漫長、昂貴且費(fèi)力，且可重復(fù)性較差。不僅如此，雖然小鼠和人類的性別決定和睪丸功能系統(tǒng)通常相似，但它們并不完全保守，許多單基因缺陷導(dǎo)致的遺傳疾病無法在小鼠中成功建模。

3、睪丸細(xì)胞培養(yǎng)模型：目前尚無可靠的睪丸細(xì)胞系可以概括體內(nèi)各類睪丸細(xì)胞。而在含血清培養(yǎng)基中2d培養(yǎng)原代睪丸細(xì)胞會導(dǎo)致其正常特性喪失，并且基因表達(dá)模式迅速與正常睪丸分化。

4、睪丸類器官培養(yǎng)模型：此方法是從小鼠或人類睪丸中提取原代細(xì)胞或基于干細(xì)胞的方法，先獲取各類睪丸細(xì)胞，利用3d培養(yǎng)技術(shù)使得各類細(xì)胞自組裝產(chǎn)生球狀的睪丸類器官，通過各類細(xì)胞的細(xì)胞間交流使得睪丸細(xì)胞維持其特性。可以作為探索正常睪丸發(fā)育和相關(guān)病理的有用且強(qiáng)大的平臺。但睪丸具有連續(xù)不斷循環(huán)系統(tǒng)，生殖藥物、生殖毒物均會通過毛細(xì)血管經(jīng)過血-睪丸屏障進(jìn)出睪丸，對睪丸中精子發(fā)生產(chǎn)生重要的影響。睪丸類器官的培養(yǎng)環(huán)境無法模擬循環(huán)系統(tǒng)中生殖藥物/毒物對精子發(fā)生的影響。仍無法總之，目前欠缺有效男性不育發(fā)病機(jī)制研究模型限制了生殖藥理學(xué)、生殖毒理學(xué)新技術(shù)的研發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種基于微流控的睪丸器官芯片及其制備方法與應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于微流控的睪丸器官芯片，所述睪丸器官芯片包括兩個微通道單元、一個膜層結(jié)構(gòu)、精原干細(xì)胞(spermatogonia?stem?cells，ssc)、睪丸支持細(xì)胞(sertoli?cells，sc)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig?cells，lc)；所述微通道單元包括入口微通道、培養(yǎng)微通道和出口微通道；所述兩個微通道單元中的培養(yǎng)微通道分別位于膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，形成夾心結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)微通道的底部分別與膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)連通；所述膜層結(jié)構(gòu)兩側(cè)分別附有纖維連接蛋白和iv型膠原蛋白；所述精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞位于其中一個微通道單元的培養(yǎng)微通道，形成精子發(fā)生層；所述睪丸間質(zhì)細(xì)胞位于另一個微通道單元的培養(yǎng)微通道，形成營養(yǎng)層；所述營養(yǎng)層通過膜層結(jié)構(gòu)為精子發(fā)生層輸送營養(yǎng)物質(zhì)。

4、本發(fā)明構(gòu)建了一種基于微流控的睪丸器官芯片，該芯片具有仿生3d結(jié)構(gòu)可以模擬人睪丸類器官功能。本發(fā)明芯片通過具有一定通透性的膜層結(jié)構(gòu)，將精原干細(xì)胞、支持細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞分開培養(yǎng)，但又能保證睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為營養(yǎng)層為精子發(fā)生層提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，這種分開獨(dú)立培養(yǎng)的方式也方便后續(xù)精原干細(xì)胞、支持細(xì)胞與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離。同時，在膜層結(jié)構(gòu)兩側(cè)分別附有纖維連接蛋白和iv型膠原蛋白提高了膜層結(jié)構(gòu)兩側(cè)細(xì)胞的粘附性，確保位于下層的細(xì)胞不會有下墜的風(fēng)險，一直貼附于膜層結(jié)構(gòu)上。

5、作為第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述入口微通道和出口微通道的寬度1mm；所述培養(yǎng)微通道的長為12mm，寬為7mm，深度為0.9mm；所述膜層結(jié)構(gòu)膜層結(jié)構(gòu)的長為20mm，寬為7mm，厚度為0.5mm。

6、作為第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述精子發(fā)生層的精原干細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞與營養(yǎng)層的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分別粘附于膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)上。細(xì)胞粘附于膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)從細(xì)胞組成和生物功能模擬睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)，通過間質(zhì)細(xì)胞對精子發(fā)生層提供精原干細(xì)胞生長的必要成分。

7、作為第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述膜層結(jié)構(gòu)為碳酸聚酯濾膜，厚度0.2mm，濾過孔徑為0.4μm。

8、本發(fā)明采用碳酸聚酯濾膜作為膜層結(jié)構(gòu)，使其通透性更好，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送。

9、作為第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，還包括入口微室和出口微室，所述入口微室和出口微室的分別半徑為1mm；所述入口微室和出口微室與培養(yǎng)液容器連接。

10、作為第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，還包括檢測功能模塊。本發(fā)明中通過檢測芯片通道中輸入細(xì)胞培養(yǎng)液與輸出培養(yǎng)液的成分差異(營養(yǎng)液成分差異、細(xì)胞分泌成分差異、細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測等)，構(gòu)成檢測功能模塊，通過檢測功能模塊可實(shí)時檢測睪丸器官芯片中細(xì)胞自組裝情況、三種功能細(xì)胞的關(guān)鍵功能基因表達(dá)情況以及當(dāng)在微流控睪丸器官芯片培養(yǎng)環(huán)境中引入生殖藥理/毒理因素，可以動態(tài)評估器官芯片的主要功能指標(biāo)變化，以評估藥理/毒理因素對精子發(fā)生的影響。

11、第二方面，本發(fā)明提供一種睪丸器官芯片的制備方法，包括以下步驟：

12、步驟1：使用聚二甲基硅氧烷在模具中加熱固化，得到兩個微通道單元連接在一起的整體結(jié)構(gòu)；

13、以培養(yǎng)微通道部位將其切割為上下兩部分，得到獨(dú)立的兩個微通道單元；

14、在微通道單元的入口微通道和出口微通道部位沖壓打孔，得到微通道單元的入口微通道和出口微通道；

15、步驟2：準(zhǔn)備碳酸聚酯濾膜；

16、步驟3：將步驟1的睪丸器官芯片的兩個微通道單元的培養(yǎng)微通道包夾碳酸聚酯濾膜，形成夾心結(jié)構(gòu)并熱壓粘合，得睪丸器官芯片結(jié)構(gòu)；

17、步驟4：將精原干細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞通過入口微通道輸入所述培養(yǎng)微通道后進(jìn)行培養(yǎng)。

18、作為第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式，還包括在所述膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)分別添加纖維連接蛋白或/和膠原蛋白ⅳ混合涂層。

19、本發(fā)明在膜層結(jié)構(gòu)的兩側(cè)分別加入纖維連接蛋白或/和膠原蛋白ⅳ混合涂層，這些成分形成生精小管的基底層，可以改善培養(yǎng)中的細(xì)胞粘附，提高細(xì)胞在膜層結(jié)構(gòu)上的粘附性。

20、作為第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟4細(xì)胞輸入的步驟，具體如下：

21、步驟1：將支持細(xì)胞通過植入其中一個微通道單元的培養(yǎng)微通道內(nèi)，靜止，使其粘附在膜層結(jié)構(gòu)的一側(cè)上；

22、步驟2：將睪丸間質(zhì)細(xì)胞植入其中另一個微通道單元的培養(yǎng)微通道內(nèi)，靜止，使其粘附在膜層結(jié)構(gòu)的另一側(cè)上；

23、步驟3：將精原干細(xì)胞通過植入粘附有支持細(xì)胞的微通道單元的培養(yǎng)微通道內(nèi)。

24、本發(fā)明芯片中的細(xì)胞種植順序經(jīng)過特定設(shè)計：根據(jù)睪丸生精小管的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生理學(xué)功能，首先種植睪丸支持細(xì)胞將為精原干細(xì)胞提供細(xì)胞定植的條件，并通過睪丸支持細(xì)胞的分泌產(chǎn)物為精原干細(xì)胞良好增殖提供條件。在濾膜另一側(cè)種植間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)物為精原干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，模擬了睪丸生精小管外的細(xì)胞組成及生理學(xué)功能。

25、第三方面，本發(fā)明提供所述基于微流控的睪丸器官芯片在篩選藥物中的應(yīng)用。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

27、本發(fā)明睪丸器官芯片具有特有膜層結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)早期細(xì)胞與細(xì)胞間粘附、細(xì)胞與膜層的粘附，促進(jìn)細(xì)胞完成自組裝及重排實(shí)現(xiàn)基底小室的構(gòu)建。

28、動物模型能夠進(jìn)行藥理學(xué)/毒理學(xué)研究但研究過程漫長、昂貴且費(fèi)力，且可重復(fù)性較差，探索藥理/毒理因素對男性生殖系統(tǒng)影響過于籠統(tǒng)，難以細(xì)致研究。本發(fā)明睪丸器官芯片具有操作性強(qiáng)、可持續(xù)性強(qiáng)、成本低廉等優(yōu)勢。

29、本發(fā)明睪丸器官芯片相對細(xì)胞培養(yǎng)模型與類器官模型具有更加貼近男性生殖系統(tǒng)組織學(xué)和生理學(xué)方式，在研究平臺方面具有先天優(yōu)勢。且微流控器官芯片能夠有效控制器官芯片中睪丸類器官組織中受到藥理學(xué)/毒理學(xué)因素影響的時間/劑量等條件，可以更加高效研究各項(xiàng)因素對男性生殖系統(tǒng)尤其是精子發(fā)生的影響。