本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種檢測水稻野敗型三系(不育系、恢復(fù)系、保持系)和雜交種純度的引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、20世紀70年代，我國農(nóng)業(yè)科技界的一項重大發(fā)明三系雜交水稻，通過結(jié)合兩個遺傳組成不同的水稻品種(不育系與恢復(fù)系)雜交產(chǎn)生的后代(f1)，實現(xiàn)了水稻產(chǎn)量的飛躍式增長，縮短育種周期。這種雜種優(yōu)勢的利用為我國乃至世界的糧食安全方面做出了巨大的貢獻。

2、細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic?male?sterility，cms)基因與恢復(fù)基因(rf)互作系統(tǒng)，是三系雜交水稻育種與生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵因素，也是雜交種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)。三系雜交稻育種中應(yīng)用的cms系統(tǒng)主要有三種:野敗型、紅蓮型和包臺型，其中野敗型在我國被廣泛生產(chǎn)應(yīng)用。經(jīng)過長期的研究，科學(xué)家們揭示了野敗型不育系中的wa352蛋白通過與核基因表達的線粒體定位蛋白cox11相互作用，誘導(dǎo)花藥絨氈層異常降解，最終導(dǎo)致花粉敗育。恢復(fù)基因rf4編碼782個氨基酸的五肽重復(fù)(ppr)蛋白，通過介導(dǎo)wa352基因mrna的降解恢復(fù)cms-wa的育性。目前，水稻是我國主要的糧食作物之一，且雜交稻的出現(xiàn)使水稻產(chǎn)量大幅提高，然而在長期的育種過程由于人為摻雜等原因使雜交種純度和真實性降低，因此，在育種時鑒定雜交種純度顯得尤為重要。已有報道檢測wa352野敗基因的有ssr標記和scar標記等，但檢測rf4恢復(fù)基因需要多個標記連鎖分析，這需要更多的實驗步驟和技術(shù)細節(jié)會增加實驗的復(fù)雜性和成本，且判定方法較為繁瑣。

3、因此，開發(fā)出簡單高效、成本低廉的三系雜交種純度檢測中功能基因的標記，對于雜交稻的應(yīng)用和發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測水稻野敗型三系(不育系、恢復(fù)系、保持系)和雜交種純度的引物組合，所述六條引物組合用于檢測水稻野敗不育基因wa352、主效恢復(fù)基因rf4和內(nèi)參基因actin，可以在單個泳道中同時檢測并區(qū)分野敗型的父母本和雜交種。所述用于檢測wa352基因的引物對wa352-2的正向引物和反向引物的序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的核苷酸序列；用于檢測rf4基因的引物對rf4-3的正向引物和反向引物的序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的核苷酸序列；用于檢測內(nèi)參基因基因的引物對actin-3的正向引物和反向引物的序列如seq?idno.5和seq?id?no.6所示的核苷酸序列。核苷酸序列如下：

2、seq?id?no.1：gaggattttgcctcccctcc

3、seq?id?no.2：ggtgcaacctagccaagtct

4、seq?id?no.3：ctttagttcaataattagcgatct

5、seq?id?no.4：actaacgcgtcttccatcct

6、seq?id?no.5：gaggaacatccaattttgctga

7、seq?id?no.6：cacatacattgctggtgcatt

8、一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測水稻野敗型三系(不育系、恢復(fù)系、保持系)和雜交種純度的引物組合，所述引物組合包括檢測wa352基因的引物對wa352-2、檢測rf4基因的引物對rf4-3和檢測內(nèi)參基因的引物對actin-3；所述引物對wa352-2的正向引物和反向引物的序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；所述引物對rf4-3的正向引物和反向引物的序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；所述引物對actin-3的正向引物和反向引物的序列如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。

9、進一步的，所述引物組合中，引物對wa352-2、rf4-3和actin-3的濃度比例為1:11:3。即，seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5、seq?id?no.6的引物濃度用量比例為1:1:11:11:3:3。

10、在上述用量比例下，擴增得到的條帶亮度均等無雜帶。

11、另一方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定水稻野敗型三系和雜交種純度的方法，所述方法包括如下步驟：

12、(1)提取待測水稻的基因組dna；

13、(2)采用上述檢測水稻野敗型三系(不育系、恢復(fù)系、保持系)和雜交種純度的引物組合，以待測水稻的基因組dna為模板，對其進行pcr擴增；

14、(3)在2％的瓊脂糖凝膠中檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小和數(shù)量判斷野敗基因wa352、主效恢復(fù)基因rf4和內(nèi)參基因actin的基因型。

15、在一個實施方式中，所述pcr擴增的反應(yīng)體系為：dna聚合酶buffer?2～10μl，mgcl2溶液(25mm)0.6～3.2μl，dntps?0.4～2.0μl，dna聚合酶0.05～1.0μl，混合引物組0.5～2μl，基因組dna1.2～4.0μl，ddh2o。

16、優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系為10μl反應(yīng)體系，dna聚合酶buffer?2μl，mgcl2溶液(25mm)0.6μl，dntps?0.8μl，dna聚合酶0.05μl，混合引物組0.8μl，基因組dna1.2μl，ddh2o補齊。

17、在一個實施方式中，所述pcr擴增的pcr反應(yīng)程序為94℃～98℃預(yù)變性2～10min；94℃～98℃變性30s～60s，42℃～65℃退火30s～60s，72℃延伸30s～60s，28～35個循環(huán)；72℃延伸3～10min；12℃冷卻5～20min。

18、優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)；72℃延伸7min；12℃冷卻20min。

19、所述判定野敗型三系父母本和雜交種的方法如下：如果擴增產(chǎn)物為604bp和108bp兩條帶，則判定該水稻樣本只攜帶wa352基因，為野敗不育系；如果擴增產(chǎn)物為267bp和108bp兩條帶，則判定該水稻樣品只攜帶功能型rf4恢復(fù)基因，為野敗恢復(fù)系；如果擴增產(chǎn)物為108bp單一條帶，則判定該水稻樣品不攜帶wa352和rf4基因，為野敗保持系；如果擴增產(chǎn)物為604bp、267bp和108bp三條帶，則判定該水稻樣品同時攜帶wa352和rf4基因，為野敗的雜交種。

20、另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測水稻野敗型三系和雜交種純度的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物組合。

21、另一方面，本發(fā)明還提供了上述引物組合在制備用于檢測水稻野敗型三系和雜交種純度的試劑盒中的應(yīng)用。

22、另一方面，本發(fā)明還提供了上述引物組合在選育水稻三系野敗型新品種的應(yīng)用。

23、另一方面，本發(fā)明還提供了上述引物組合在檢測水稻野敗型三系和雜交種純度的中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明通過篩選出來的6條特異性引物，可實現(xiàn)單個泳道同時檢測野敗基因wa352、主效恢復(fù)基因rf4和內(nèi)參基因的基因型。對水稻中的28份野敗型三系父母本和雜交種材料進行鑒定，發(fā)現(xiàn)能夠準確區(qū)分野敗型三系父母本和雜交種的基因型。本發(fā)明的檢測方法成本低廉、操作簡便、綠色環(huán)保，在瓊脂糖膠中清晰分辨不同帶型，且無雜帶。本發(fā)明的檢測方法在現(xiàn)階段的野敗型三系雜交水稻育種過程中，可起到分子輔助選擇的作用，可以有效的縮短育種年限，同時可以彌補野敗型雜交種純度檢測缺少功能標記的空白。