本申請涉及神經元細胞培養，具體是一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法。

背景技術：

1、現有小鼠腦神經元原代分離和培養技術，主要是兩條路徑：

2、1是對胎鼠(e16-e18)進行酶解法分離后培養。通過選擇溫和的酶和酶解條件，以及適宜的培養條件，使得脆弱的神經元從腦中分離出來。其中缺點主要是：1.小鼠胎鼠需要對孕天數控制，若一次獲取量較大則難獲取足夠細胞量。2.胎鼠本身神經系統較為幼稚，未形成小膠質細胞等，無法很好代表成年后小鼠神經元狀態。3.胎鼠由于尚在母體中，許多干預條件受限，如飲食、運動等，進而影響較多針對神經元的藥物或食品開發等。

3、2是對成年小鼠進行酶解梯度分離后培養。現行文章較少，主要是通過選擇合適的酶分離出大致的細胞懸液，再通過不同的細胞的密度不同，設置不同的梯度液從中分離出所需的神經元細胞。其中主要缺點是：1.獲得數量少。平均8周齡成年小鼠腦重量為100mg左右，神經元數量約為10^7個，此法獲得的神經元在10^5量級，所得細胞數偏少，難以供給相關實驗。2.存活難度高。此法獲得的神經元純度不高，含有的少量小膠質細胞在失去屏障的培養環境中，可能破壞神經元，進而影響神經元存活。

技術實現思路

1、針對現有技術中的問題，本發明提出的一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，對解離和梯度液進行進一步優化，成功完成了對成年小鼠腦神經元分離和培養，獲得數量和活率更好的神經元。

2、本發明采用的技術方案是：一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，包括以下步驟：

3、(1)從小鼠海馬中分離并獲取組織細胞；

4、(2)對組織細胞進行沖洗、重懸操作，獲得細胞懸浮液；

5、(3)配置optiprep密度梯度液，將細胞懸浮液置于密度梯度液頂層，離心；

6、所述optiprep密度梯度液從底部往上依次是：

7、第1層：173ul?optiprep+827ul?habg；

8、第2層：124ul?optiprep+876ul?habg；

9、第3層：99ul?optiprep+901ul?habg；

10、第4層：74ul?optiprep+926ul?habg；

11、(4)收集步驟(3)梯度離心后從底部往上的第3層神經元細胞懸液；

12、(5)將步驟(4)收集的神經元細胞懸液清洗、重懸后置于完全培養基中培養。

13、進一步地，步驟(1)具體包括：

14、(1.1)配置木瓜蛋白酶工作液，與habg于離心管中37℃預熱；

15、(1.2)取小鼠海馬切片置于步驟(1.1)的離心管中，孵育30℃，30min，170轉/min，使組織懸浮；

16、(1.3)將組織轉移至含habg的gentlemacstmc?tubes中，室溫放置5min；

17、(1.4)放入gentlemacs?octo?dissociator?with?heaters中，啟動37c_abdk_01程序，等待30min；完成后取出，瞬離后將組織殘渣和液體通過細胞篩過濾。

18、在上述方案中，所述木瓜蛋白酶工作液的濃度為2mg/ml。

19、進一步地，所述步驟(2)具體包括：

20、(2.1)沖洗組織細胞，離心，去上清，再加入d-pbs重懸細胞，加入450ul?removalresolution，吸混均勻；

21、(2.2)在上層緩慢加入d-pbs，4℃，3000g離心10min；

22、(2.3)吸棄上兩層相，加入d-pbs，輕輕倒置混勻；

23、(2.4)4℃，1000g離心10min，全制動后，吸棄上清，向剩余的細胞中加入habg。

24、進一步地，步驟(3)中的離心條件為：離心800g，15min，室溫。

25、在上述方案中，所述步驟(5)中的清洗、重懸包括：

26、(5.1)清洗取出的神經元，加入habg，離心200g，2min，室溫；

27、(5.2)加入紅細胞裂解液，冰上裂解5min，加入habg終止；

28、(5.3)去上清，重懸于habg中，離心200g，2min，室溫；

29、(5.4)去上清，手指敲擊試管底部，使細胞顆粒變松，重懸于完全培養基中。

30、本發明中，所述完全培養基包括25ml?neuralbasal-a，0.5ml?b27，0.5mm?gln，250ul?penicillin-streptomycin?solution。

31、進一步地，步驟(5)中所述完全培養基中培養包括，在培養1h后,吸棄培養基，立即將1ml?nbbg緩慢輕輕加入培養皿中,抽吸后重復，共3次，保持最后一次沖洗；第一次在6-8h半量換液，后每2.5d/半量換液。

32、本發明具有以下有益技術效果：

33、1.分離腦中神經元時，需要在盡可能溫和，不傷害神經元的前提下，盡量使神經元與周圍髓鞘，小膠質細胞等分離。本發明中使用的酶和離心采用的不同濃度梯度，經過多方考量和驗證，確保為適合成年小鼠神經元分離的最佳配方。

34、2.成年小鼠腦神經元培養時，由于已經是終末分化的無分裂能力細胞，其培養環境需求極為苛刻。故本發明中提及的培養條件，培養基選擇等極為關鍵，影響最終細胞培養的活率。采用本發明的培養基和培養條件能獲得數量和活率更好的神經元。

35、3.成年小鼠腦神經元原代提取，能為科研人員和醫學工作者提供更準確的成年神經元模型。并為原有胎鼠原代神經元模型中無法完成的飲食、運動等的神經干預提供有效的細胞模型。提高成年小鼠原代神經元分離的細胞數量和活率，為后續相關實驗進一步提高工作效率。

技術特征：

1.一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：步驟(1)具體包括：

3.根據權利要求2所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶工作液的濃度為2mg/ml。

4.根據權利要求1所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：所述步驟(2)具體包括：

5.根據權利要求1所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：步驟(3)中的離心條件為：離心800g，15min，室溫。

6.根據權利要求1所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：所述步驟(5)中的清洗、重懸包括：

7.根據權利要求1或6所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：所述完全培養基包括25ml?neuralbasal-a，0.5ml?b27，0.5mm?gln，250ul?penicillin-streptomycin?solution。

8.根據權利要求7所述一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，其特征在于：步驟(5)中所述完全培養基中培養包括，在培養1h后,吸棄培養基，立即將1ml?nbbg緩慢輕輕加入培養皿中,抽吸后重復，共3次，保持最后一次沖洗；第一次在6-8h半量換液，后每2.5d/半量換液。

技術總結
本發明請求保護一種成年小鼠腦神經元原代分離及培養方法，包括從小鼠海馬中分離并獲取組織細胞；對組織細胞進行沖洗、重懸操作，獲得細胞懸浮液；配置OptiPrep密度梯度液，梯度離心；收集梯度離心后的純化神經元；對純化后的神經元清洗、重懸后置于完全培養基中培養。本發明優化了酶和梯度離心的不同濃度梯度，使能獲得純度更好的神經元。配制適合小鼠神經元培養的完全培養基，提高成年小鼠原代神經元分離的細胞數量和活率，為后續相關實驗進一步提高工作效率。

技術研發人員：戴雙雙,糜漫天,何雨航,馬鵬嬌,郎和東
受保護的技術使用者：中國人民解放軍陸軍軍醫大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24