本發明屬于生物工程，涉及一種比活力顯著提高的來源于近平滑假絲酵母(candida?parapsilosis)的羰基還原酶突變體，其編碼核酸，含有所述重組羰基還原酶突變體基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及利用所述羰基還原酶突變體作為催化劑在制備地爾硫卓關鍵中間體2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯中的應用。

背景技術：

1、地爾硫卓是一種鈣離子通道阻滯劑，是一種非常重要的心血管治療藥物。該藥物最早于19世紀70年代由日本田邊公司研發，繼而在世界各地廣泛應用。目前心血管疾病發病率和死亡率位居第一，且還在不斷上升，已經嚴重影響到人類健康。治療此類疾病藥物的需求不斷增加，合成該藥物中間體的重要性不言而喻。

2、化學法合成地爾硫卓藥物的方法路徑長，反應條件苛刻，原料利用率低、生產能耗等成本較高。相較而言，生物催化法具有反應條件溫和、環境友好等諸多優勢。(2r,3s)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯[(2r,3s)-mpgm]是合成地爾硫卓的關鍵手性中間體。1993年，田邊公司篩選到一種來自黏質沙氏菌，能夠高效催化外消旋體拆分制備高光學純度的產物(2r,3s)-mpgm(j.ferment.bioeng.1993,75:93-98)并應用于工業生產。同年，takejishibatani等也發現了能夠催化底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯還原的多種微生物，酶促還原產物可以進一步環化生成光學活性的mpgm，但是具有高立體選擇性的菌株活性極低(us?005204248a)。順應兩個方向的研究路線，后續相繼有了多種高活力、高立體選擇性的脂肪酶的研究，同時也有了多種催化底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯不對稱還原的野生菌株以及重組羰基還原酶。

3、上述兩種研究思路，各有優勢，但也有局限性。脂肪酶拆分法的理論產率僅為50％，有原料浪費、副產物難以利用等問題，生產成本較高。酶促不對稱合成法雖然具有理論收率為100％的明顯優勢，但是催化劑活性較低，無法達到工業需求。提高還原酶的催化活力，打破不對稱合成法的局限性，是化學-酶法制備地爾硫卓的最可行方案。

4、近年來對底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯的酶促還原反應大多采用重組羰基還原酶。2021年本技術發明人課題組率先報道通過基因挖掘獲得來源于近平滑假絲酵母(candida?parapsilosis)的羰基還原酶cpkr，首次實現底物上載量和時空產率的大幅提高(mol.catal.2021,510:111670)。2023年，本技術發明人通過計算輔助的羰基還原酶cpkr熱穩定性改造取得顯著成效，得到突變體cpkrm2(acs?catal.2023,13:7407-7416)。2022年，陳芬兒等報道的羰基還原酶lfsdr1催化還原2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯，底物上載量達413mm，但存在較為嚴重的底物抑制問題(chem.commun.2022,58:9010-9013)。2024年，陳芬兒課題組報道的又一羰基還原酶sscrm2(biotechnol.j.2024,19:e2300250)，其底物上載量有了較大提升，但是仍存在酶的比活力較低等問題，在生產上仍有一定的局限性。

技術實現思路

1、針對現有技術中用于催化合成2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯的羰基還原酶的比活力較低、穩定性較差的問題，本發明提供一種羰基還原酶突變體及其在制備地爾硫卓關鍵中間體中的應用。

2、更具體地，本發明在前期改造獲得高熱穩定性的羰基還原酶突變體cpkrm2的基礎上(見專利cn113174377b)，通過定向進化策略對其進行活力改良，提供一種比活力顯著提升且穩定性保持較好的突變體，所述羰基還原酶突變體基因、含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，并應用所述的重組羰基還原酶突變體，高效地催化合成2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯。

3、本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

4、本發明采用的技術方案之一：

5、提供一種羰基還原酶突變體。所述羰基還原酶突變體是以實驗室前期獲得的羰基還原酶cpkrm2為母本蛋白，對其經過一個或多個氨基酸取代得到的羰基還原活性提高的衍生蛋白質。

6、其中，所述羰基還原酶cpkrm2的核酸序列如序列表seq?id?no.1所示，其氨基酸序列如序列表seq?id?no.2所示。

7、在研究過程中，將所述羰基還原酶cpkrm2的核酸序列連接于質粒pet-28a(+)中，命名為pet-28a(+)-cpkrm2。

8、本發明中，將底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯與所述含輔因子nadph的羰基還原酶cpkrm2的晶體結構進行分子對接，定位底物及輔因子nadph結合位點附近的關鍵殘基，基于此進行單點飽和突變；在活性篩選的基礎上，將活性提高的突變體的突變氨基酸殘基進行組合，進而提供了多種活性顯著提高的羰基還原酶突變體，所述羰基還原酶選自氨基酸序列如下的蛋白質：

9、(1)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸；

10、(2)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸；

11、(3)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸；

12、(4)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸；

13、(5)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺；

14、(6)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第102位的谷氨酸替換為賴氨酸；

15、(7)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺；

16、(8)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸；

17、(9)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸；

18、(10)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸；

19、(11)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為丙氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺；

20、(12)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第68位的丙氨酸替換為甘氨酸；

21、(13)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸；

22、(14)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸；

23、(15)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸；

24、(16)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸；

25、(17)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸；

26、(18)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸；

27、(19)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸；

28、(20)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸；

29、(21)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第243位的酪氨酸替換為色氨酸，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸；

30、(22)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第203位的纈氨酸替換為蘇氨酸，第240位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第172位的異亮氨酸替換為亮氨酸，第197位的苯丙氨酸替換為蘇氨酸，第273位的丙氨酸替換為谷氨酰胺，第199位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺，第270位的亮氨酸替換為纈氨酸，第19位的谷氨酰胺替換為酪氨酸。

31、本發明采用的技術方案之二：

32、還提供了一種分離的核酸，所述的核酸是編碼所述羰基還原酶突變體的核酸分子。

33、本發明所述核酸的制備方法為本領域的常規制備方法，所述制備方法較佳地包括：

34、通過基因克隆技術獲得編碼羰基還原酶突變體的dna分子；或通過人工序列全合成法得到編碼羰基還原酶突變體的dna分子。

35、本發明采用的技術方案之三：

36、提供一種包含本發明所述羰基還原酶突變體核酸序列的重組表達載體。

37、其可通過本領域常規方法將本發明的羰基還原酶突變體基因核酸序列連接于各種合適的載體上構建而成。

38、所述載體可以是本領域的各種常規載體，優選質粒，進一步優選質粒pet-28a(+)。所述羰基還原酶突變體基因可以操作性地連接于所選載體中適合表達的調控序列的下游，以實現所述羰基還原酶突變體的組成型或誘導型表達。

39、本發明采用的技術方案之四：

40、一種包含本發明所述羰基還原酶突變體核酸的重組表達轉化體。

41、將含有本發明所述羰基還原酶突變體核酸序列的重組表達載體轉化至宿主細胞中，制得所述重組表達轉化體。

42、宿主細胞可以是本領域各種能夠使所述重組表達載體穩定復制，且所述羰基還原酶突變體基因可被有效表達的常規宿主細胞，宿主細胞優選大腸桿菌e.coli?bl21(de3)。

43、本發明采用的技術方案之五：

44、一種所述重組羰基還原酶突變體的制備方法。本發明所述重組羰基還原酶的制備方法較佳地為：培養如上所述的重組表達轉化體，分離獲得重組表達的羰基還原酶。

45、其中培養重組表達轉化體所用的培養基可以為本領域任何可使轉化體生長并產生本發明所述重組羰基還原酶的培養基。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，可以根據宿主細胞類型和培養方法等因素的不同，按本領域常規知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并生產所述的重組羰基還原酶即可。重組表達轉化體培養的具體操作可按本領域常規操作進行。

46、示例的，取20μl重組羰基還原酶突變體的甘油菌菌液，接種于4ml含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養基試管中，在搖床37℃，200rpm條件下培養12h。取試管菌液500μl接種于含50ml?lb液體培養基的500ml搖瓶中，在搖床37℃，200rpm條件下培養3-4h至od600達到0.5～1.0，加入終濃度為0.1～1.0mm(優選0.2mm)的異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)進行產酶誘導，在16℃繼續培養24h。使用離心機進行離心收集菌體。使用10ml磷酸鉀緩沖液(100mm,ph?6.0)重懸菌體，在冰水浴中超聲破碎15min，獲得粗酶液。其中所述lb液體培養基配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化鈉10g/l。

47、本發明中蛋白質在n端有組氨酸標簽(his-tag)，因此可以使用ni?nta?beads6ff型填充鎳柱進行蛋白純化。酶純化緩沖液分別為：

48、a液：20mm?pbs緩沖液，500mm?nacl，35mm咪唑，2mmβ-巰基乙醇。

49、b液：20mm?pbs緩沖液，500mm?nacl，160mm咪唑，2mmβ-巰基乙醇。

50、c液：20mm?pbs緩沖液，150mm?nacl，1mm二硫蘇糖醇。

51、用5-10倍柱體積的a液洗去與鎳柱結合能力較弱的雜蛋白，再用3-5倍柱體積的b液洗脫被鎳柱吸附的目的蛋白，并收集洗脫液。洗脫液用超濾管離心至0.5ml以下后加入c液進行置換去除咪唑，重復三次，獲得純酶，液氮速凍后存入-80℃冰箱備用。

52、分光光度計測定酶的比活力。測活體系為1ml，包含970μl的磷酸鉀緩沖液(100mm,ph?6.0)，10μl底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯(100mm，溶解于二甲基亞砜)，10μl輔酶nadph(10mmol/l，溶解于kpb)和10μl孵育后的酶液，反應溫度為35℃，檢測340nm下吸光度值的變化。根據酶活定義公式及朗博比爾定律計算得到酶活力。

53、本發明還提供所述重組羰基還原酶突變體熱穩定性的檢測方法。本發明通過圓二色光譜(cd)檢測酶的熔解溫度。熔解溫度是指蛋白在某一條件下解折疊一半所對應的反應溫度，用于表征熱力學穩定性。具體地，使用所述純化后的蛋白樣品，稀釋至0.5mg/ml后加入圓二色譜儀的樣品池，設置升溫程序從20℃至80℃，以2℃/min的速度上升，掃描蛋白在180-260nm波長范圍內的吸光值變化，然后通過global?3軟件進行數據分析得到熔解溫度tm。

54、本發明采用的技術方案之六：

55、提供了一種羰基還原酶突變體催化劑，其是以下形式中的任意一種：

56、(1)培養所述重組表達轉化體，分離含有所述羰基還原酶突變體的靜息細胞；

57、(2)對形式(1)所述靜息細胞冷凍干燥而得到的凍干細胞；

58、(3)對形式(1)所述靜息細胞進行破碎，獲得含有所述羰基還原酶突變體的細胞破碎液；

59、(4)對形式(3)所述細胞破碎液冷凍干燥而得到的凍干酶粉。

60、細胞培養結束后，離心收集沉淀的菌體細胞，即為重組表達轉化體的靜息細胞；將所得細胞懸浮于磷酸鉀緩沖液中，超聲破碎，破碎液離心，收集上淸液，即可獲得所述重組羰基還原酶的細胞破碎液。分別對靜息細胞和細胞破碎液進行冷凍干燥，可以獲得凍干細胞和凍干酶粉。

61、本發明采用的技術方案之七：

62、本發明所述羰基還原酶突變體(cpkr突變體)或所述羰基還原酶突變體催化劑催化底物羰基化合物不對稱還原以制備地爾硫卓關鍵中間體中的應用。

63、羰基還原酶屬于氧化還原酶類，需要nadph作為電子供體，反應生成nadp+。nadph成本很高，故在酶催化工藝中通常偶聯一個輔酶循環再生體系，使用葡萄糖脫氫酶gdh、甲酸脫氫酶fdh、異丙醇脫氫酶ipadh等中的某一種脫氫酶，將nadp+在反應條件下還原為nadph，以降低原料成本。

64、所述羰基化合物選自2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯。

65、所述羰基化合物的還原產物為2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯，所述2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯經過分子內環化，用以合成地爾硫卓合成的關鍵手性中間體(2r,3s)-mpgm。

66、具體地，催化反應條件：底物濃度為100～600mm，輔酶nadp+濃度為0.1～2.0mm，葡萄糖150～900mm，葡萄糖脫氫酶gdh的用量為2～15u/ml，反應溫度為20～45℃，ph?4～9，反應時間為0.5～24h。

67、反應過程中間歇取樣，產物生成物質的量采用液相色譜進行分析。分析條件如下：色譜柱為大賽璐液相分析色譜柱chiral?oj-h(25cm×4.6mm，5μm)，流動相為正己烷/異丙醇(70/30，v/v)，流速為0.5ml/min，柱溫35℃，檢測波長為254nm。

68、與現有技術相比，本發明具有顯著優勢：

69、本發明所述的重組羰基還原酶突變體在催化底物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3-羰基丙酸甲酯不對稱還原制備2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯的應用中，具有催化活性高、熱穩定性好的顯著優勢。所述還原產物2-氯-3-(4-甲氧基苯基)-3(s)-羥基丙酸甲酯經過分子內環化，可以高效合成地爾硫卓合成的關鍵手性中間體(2r,3s)-mpgm，生產成本低，適于工業化應用，在地爾硫卓等藥物中間體的生產過程中具有很好的工業開發應用前景。