本發明涉及pcr，具體地說，涉及一種全預混式熒光pcr試劑盒及穩定劑。

背景技術：

1、熒光pcr技術因其高靈敏度、高特異性和快速結果輸出等特點，在生物學研究、醫學診斷、食品安全等多個領域得到了廣泛應用，而且為了便于使用，有相當多的商業公司制造熒光pcr試劑盒產品，其中有三類，一類是將pcr反應液與酶mix分開為兩個組分，使用時需按比例計算用量并進行混合，比較繁瑣而且有誤操作的可能；第二類是將熒光pcr反應液分裝、凍干，使用時加水復溶即可，缺點在于需要專用凍干設備、工藝復雜、整體成本較高，而且復溶后不宜長期保存，因此多應用于微流控芯片或卡盒中來一次性使用；第三類是將熒光pcr反應液的全部組分置于一管，即全預混式試劑盒，使用更加方便且成本較低，但是，全預混式熒光pcr試劑盒在長期保存時存在穩定性問題，靈敏度會有所下降，一定程度上限制了其應用。本發明主要解決全預混式熒光pcr試劑盒保存時靈敏度下降的穩定性問題。

2、專利申請cn114934107a公開了一種可冷凍保存多重逆轉錄熒光pcr預混反應液，其穩定劑為金屬離子螯合劑，創新性較低，并且主要評估長期冷凍保存時的ct值是否變化，對檢測限濃度樣本的檢測性能沒有進行評估。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種全預混式熒光pcr試劑盒及穩定劑，以解決全預混式熒光pcr試劑盒長期保存時靈敏度下降的穩定性問題。本發明的應用于全預混式熒光pcr試劑盒的穩定劑，配制簡單，無需凍干，可以使全預混式熒光pcr試劑盒37℃保存7天并凍融3次、或-20℃保存12個月靈敏度不下降，且對多個供應商的熱啟動taq酶均適用。全預混式熒光pcr試劑盒為何長期保存時穩定性下降，原因尚未有定論，有觀點認為taq酶的5’外切酶活性在保存過程中切除了5’熒光探針基團，有的觀點認為長期保存時熒光基團不穩定而降解，本發明認為主要因素不在于此，而在于引物探針與熱啟動taq聚合酶共同保存時，高濃度的引物競爭抗taq酶抗體與taq酶的結合，導致少部分抗體被置換出去，而這部分抗體脫離了與taq酶的結合狀態變得容易變性，此過程在長期保存、凍融過程中不斷重復，將導致相當比例的抗taq酶抗體變性，最終較多引物能與taq酶結合并啟動非特異擴增，從而導致反應靈敏度下降。本發明的核心在于同時使用組氨酸等保護抗體的組分結合taq酶適配體使用，使試劑盒在37℃保存7天并凍融3次、或-20℃保存12個月時靈敏度不下降。

2、本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

3、第一方面，本發明提供一種全預混式熒光pcr試劑盒的穩定劑，包括組氨酸和taq酶適配體。

4、作為本發明的一些具體實施方式，所述組氨酸的濃度為0.01m-0.05m。

5、作為本發明的一些具體實施方式，所述taq酶適配體的濃度為1nm-20nm。

6、作為本發明的一些具體實施方式，所述taq酶適配體具有如seq?id?no.1(caagacgggcgggtgtggtaggcgcccgtg)所示的核苷酸序列。

7、作為本發明的一些具體實施方式，所述穩定劑還包括nacl、tween-20、海藻糖中的至少一種。

8、作為本發明的一些具體實施方式，所述nacl的濃度為0.05m-0.15m；

9、和/或，所述tween-20的體積分數為0.5‰-10‰；

10、和/或，所述海藻糖的濃度為0.1m-0.5m。

11、第二方面，本發明提供一種pcr預混液，包括上述任一項所述的穩定劑，還包括抗體封閉的熱啟動taq聚合酶、ung酶、mg2+和dntps。

12、作為本發明的一些具體實施方式，所述抗體封閉的熱啟動taq聚合酶的濃度為0.05-0.15u/μl；

13、和/或，所述ung酶的濃度為0.01-0.1u/μl；

14、和/或，所述mg2+的濃度為2-5mm；

15、和/或，所述dntps的濃度為200-400μm。

16、作為本發明的一些具體實施方式，所述pcr預混液由ph?8.5-8.8，濃度5-50mm的tris-hcl緩沖液進行配制。

17、第三方面，本發明提供一種全預混式熒光pcr試劑盒，包括pcr全預混液，所述pcr全預混液包括上述任一項所述的pcr預混液，還包括pcr引物和探針。

18、本發明不對pcr引物和探針的序列進行限定，用于進行pcr反應的引物和探針均可實現本發明的目的。

19、作為本發明的一些具體實施方式，所述pcr引物和探針包括檢測非洲豬瘟p72基因的引物和探針、檢測豬actin基因的引物和探針、檢測豬圓環病毒2型基因的引物和探針中的至少一種。

20、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

21、本發明的穩定劑，配制簡單，無需凍干，可以使全預混式熒光pcr試劑盒37℃保存7天并凍融3次、或-20℃保存12個月靈敏度不下降，且對多個供應商的熱啟動taq酶均適用。

技術特征：

1.一種全預混式熒光pcr試劑盒的穩定劑，其特征在于，包括組氨酸和taq酶適配體。

2.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述組氨酸的濃度為0.01m-0.05m。

3.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述taq酶適配體的濃度為1nm-20nm。

4.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述taq酶適配體具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列。

5.根據權利要求1所述的穩定劑，其特征在于，所述穩定劑還包括nacl、tween-20、海藻糖中的至少一種。

6.根據權利要求5所述的穩定劑，其特征在于，所述nacl的濃度為0.05m-0.15m；

7.一種pcr預混液，其特征在于，包括如權利要求1-6中任一項所述的全預混式熒光pcr試劑盒的穩定劑，還包括抗體封閉的熱啟動taq聚合酶、ung酶、mg2+和dntps。

8.根據權利要求7所述的pcr預混液，其特征在于，所述抗體封閉的熱啟動taq聚合酶的濃度為0.05-0.15u/μl；

9.根據權利要求8所述的pcr預混液，其特征在于，所述pcr預混液由ph?8.5-8.8，濃度5-50mm的tris-hcl緩沖液進行配制。

10.一種全預混式熒光pcr試劑盒，包括pcr全預混液，其特征在于，所述pcr全預混液包括如權利要求7-9任一項所述的pcr預混液，還包括引物和探針。

技術總結
本發明公開了一種全預混式熒光PCR試劑盒及穩定劑，穩定劑包括組氨酸和Taq酶適配體，組氨酸的濃度為0.01M?0.05M，Taq酶適配體的濃度為1nM?20nM，還包括NaCl、Tween?20、海藻糖中的至少一種。本發明公開了包括上述穩定劑的PCR預混液，以及全預混式熒光PCR試劑盒。本發明的穩定劑配制簡單，無需凍干，可以使全預混式熒光PCR試劑盒在37℃保存7天并凍融3次、或?20℃保存12個月靈敏度不下降。

技術研發人員：陳誠,徐晶晶,陳慧嫻,楊航,張震,殷波,仝中鴿
受保護的技術使用者：申聯生物醫藥（上海）股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24