本發明涉及一種寨卡病毒核酸檢測靶標以及根據該靶標設計的快檢方法和檢測試劑盒，屬于分子生物學。

背景技術：

1、

2、外泌體是胞外的脂質膜囊泡，幾乎所有的活細胞都能夠釋放外泌體。近年來，外泌體已被證明是細胞交流的重要途經，且廣泛存在于血液，尿液等體液中。mirna是一類真核生物內源性小分子單鏈rna，長度約20-24個核苷酸，在細胞中與mrna結合，引起靶mrna的降解或翻譯抑制從而發揮調控作用。目前，循環外泌體以及其中包含的microrna(mirna)作為診斷靶標已得到廣泛研究。受到病毒感染影響的細胞分泌的外泌體包含的成分會發生改變，包括發揮調控作用的mirna或其他核酸種類的改變和蛋白質含量的增減。此外，有些病毒還能夠通過外泌體分泌途徑向其他細胞傳遞病毒顆粒或病毒核酸。而寨卡病毒感染時，能夠在病毒顆粒釋放前分泌外泌體進入血液。那么，針對因細胞感染病毒分泌的外泌體相關成分進行檢測有望對寨卡病毒感染進行早期檢出。所以，通過細胞培養模擬出的病毒感染的相關模型進行外泌體分析，將有助于延長病毒感染檢測的窗口期，實現寨卡病毒感染的早發現、早診斷。

3、納米材料已在各個領域得到廣泛應用。氧化石墨烯是從氧化石墨上剝離下的單層材料，由于在碳形成的分子表面及邊緣引入了大量含氧基團，故能夠在水溶液中穩定存在，同時石墨的結構又利于核酸的吸附。在生物醫學中，納米材料能夠作為光譜猝滅劑使用。氧化石墨烯分子在吸附了含有熒光基團的核苷酸后熒光分子能夠與之發生共振能量轉移，從而無法發射出可檢測的熒光信號。若反應體系中存在能夠與之結合的靶核苷酸，則會建立更強的探針-靶標的相互作用，探針就會離開氧化石墨烯表面重新發射出熒光信號。由于核酸的吸附與解離反應時間較短，因此該方法避免了pcr方法中通過溫度變化循環來擴增目的片段的過程，大幅縮短反應時間，能夠實現靶核酸的快速檢出，且在一定程度上提升反應的靈敏度。

技術實現思路

1、寨卡病毒感染后病毒血癥程度不高，而who所推薦的核酸擴增方法檢測病毒基因組上特異性分子靶點的方法存在檢測窗口期短的問題，且在癥狀出現后一周內仍難以檢出。所以建立一種能夠用于現場的zikv感染早期檢測方法對于寨卡病毒防控以及疫情的預測預警具有重要意義。

2、寨卡病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播，而全身性的病毒感染就需要寨卡病毒滲透到血管中并通過循環系統進入各組織。所以，血管就成為了重要的通道，有重要的研究意義。此外，在感染早期，病毒還未通過身體的各屏障進入其他組織時，血管內皮就作為早期病毒可能感染的靶細胞，且現有的研究表明寨卡病毒在感染人臍靜脈內皮細胞后可觸發細胞自噬，故我們在實驗室模擬病毒感染模型時選用人臍靜脈內皮細胞作為研究的靶細胞，來探究其在病毒感染后分泌的外泌體中mirna的變化作為感染早期的檢測靶標。

3、本發明通過對寨卡病毒感染的人臍靜脈內皮細胞(huvec)外泌體進行mirna測序分析，得到不同于正常培養細胞來源的mirna表達譜。并通過qpcr驗證了其中高表達的mir-216b-5p序列作為寨卡病毒感染細胞來源的特異性靶標進行檢測。同時，對比其他黃病毒屬病毒感染來源的外泌體，該靶標分子有良好的特異性。基于此，設計能夠與之互補結合的熒光探針，使用羧氧化石墨烯分子作為熒光猝滅劑，使熒光探針無法正常被激發光激發而發射出熒光信號。而如果樣本提取的總rna中含有mir-216b-5p，則探針與之結合后能夠從材料上解離，重新釋放熒光信號，從而判定目標核酸存在，以達到檢出的目的，反應過程原理如圖1所示。本發明公開了一種寨卡病毒感染人臍靜脈內皮細胞后釋放外泌體的mirna檢測靶標，當寨卡病毒感染人臍靜脈內皮細胞后，從細胞釋放的外泌體中獲得了mir-30c-5p、mir-216b-5p等系列分子，如圖8所示。

4、如圖9所示，加尾法和莖環法qpcr驗證結果以及擴增曲線(以u6基因為內參，結果使用log倍數展示)。

5、如圖10a和圖10b所示，對差異比較明顯的mir-30c-5p、mir-216b-5p等分子進行相對定量，分析得出mir-216b-5p具有更顯著的相對定量差異。(內參基因選擇u6，結果為rna相對表達量，使用兩樣本t檢驗，*：p<0.05,**:p<0.01，n＝7)

6、如圖11所示，針對寨卡病毒、登革病毒、乙腦病毒感染人臍靜脈內皮細胞后，對mir-216b-5p分子進行相對定量，其仍然是差異最顯著的分子，該mir-216b-5p分子的5’-3’端原始序列為：aaaucucugcaggcaaauguga。

7、所以根據該靶標設計了寨卡病毒感染人臍靜脈內皮細胞后釋放外泌體的mirna快檢方法，包括以下步驟：

8、步驟1：熒光探針的設計

9、對寨卡病毒感染人臍靜脈內皮細胞釋放的外泌體進行mirna測序分析，得到不同于正常培養細胞來源的mir-216b-5p分子，針對該mir-216b-5p分子設計與之反向互補的熒光探針，同時設計與探針反向互補的寡核苷酸片段作為陽性對照；所述mir-216b-5p的5’-3’端原始序列為，aaaucucugcaggcaaauguga，熒光探針5’-3’端序列為，熒光基團*-tcacatttgcctgcagagattt，寡核苷酸片段5’-3’端序列為，(gcg)aaatctctgcaggcaaatgtga；

10、步驟2：熒光猝滅劑的配置

11、將熒光猝滅劑和超純水用超聲勻漿儀處理結束后待用，每次使用前震蕩混勻；

12、步驟3：反應過程

13、配置核酸反應緩沖溶液，向其中加入步驟1中設計的熒光探針，然后再加入步驟2中所述的熒光猝滅劑進行熒光猝滅，隨后加入樣本中提取的總rna，混勻后靜置，最后用熒光分光光度計對混勻的待測液進行熒光檢測；

14、步驟4：檢測結果分析

15、根據使用的熒光基團選擇檢測的激發光波長和發射光波長，根據所示峰值熒光強度確定靶核苷酸是否存在。

16、進一步的，步驟1所述熒光探針長度為22bp，所述待測目標核酸序列為mirna序列，所述核糖核酸模擬物是與mir-216b-5p序列相符的dna序列，所述熒光基團*為fam*，熒光探針5’-3’端序列為，fam*-tcacatttgcctgcagagattt。檢測時根據所選擇的熒光基團選擇不同的熒光激發光波長，常用熒光基團激發光波長以及檢測波長如下：熒光基團可根據下述常用熒光基團進行選擇，不限于fam，

17、

18、進一步的，步驟2所述熒光猝滅劑為羧氧化石墨烯分子懸液，超聲勻漿儀處理時間為1小時±20分鐘。

19、進一步的，步驟3所述核酸反應緩沖溶液為含有鈉鎂離子的hepes核酸緩沖溶液。

20、本發明還涉及寨卡病毒感染人臍靜脈內皮細胞后釋放外泌體的mirna檢測試劑盒，簡稱寨卡病毒檢測試劑盒或試劑盒，包括以下部分：核酸反應緩沖溶液，特異性熒光探針，熒光猝滅劑以及陽性對照；所述核酸反應緩沖溶液為含有鈉鎂離子的hepes核酸緩沖溶液，所述特異性熒光探針為針對mir-216b-5p基因核酸序列設計的特異性熒光探針，所述熒光猝滅劑為羧氧化石墨烯分子懸液，所述陽性對照為與mir-216b-5序列相符的dna片段。

21、進一步的，所述熒光探針片段長度為22bp；所述核酸模擬物片段長度為22(25)bp。

22、進一步的，所述試劑盒還包括陰性空白對照品。

23、有益效果：本發明在材料-探針結合基礎上，將寨卡病毒感染細胞后分泌的外泌體中具有特異性的成分作為靶點，極大縮短了病毒感染的檢出時間，在保證高靈敏度的前提下實現了早發現，早治療的有益效果。此外，這一靶點也能與其他黃病毒屬病毒，如登革病毒、乙腦病毒等進行區分，對于寨卡病毒的檢測擁有良好的特異性。基于材料-探針吸附反應以及核苷酸的雜交反應時間短，避免了qpcr反應的多次變溫循環，故能夠在短時間內呈現反應結果，提升檢測效率，檢測能夠在1小時左右完成并出具檢測報告。