本發(fā)明涉及微生物檢測，特別是涉及一種檢測單增李斯特菌的試劑盒和非診斷目的的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、單增李斯特菌(listeria?monocytogenes)是常見的食源性嗜冷菌之一，同時也是人獸共患病原體之一，感染會引發(fā)高危害性的李斯特菌病，癥狀包括敗血癥、腦膜炎，并常伴有腹瀉、嘔吐及發(fā)燒等。該菌在食品加工、分銷和零售環(huán)境中廣泛存在，其嗜冷生長特性進一步增加了管理監(jiān)測難度，因此急需一種快速、靈敏且易于現(xiàn)場檢測的技術(shù)來保障食品安全以及公眾健康。

2、此外，為了進一步提高在復雜食品樣品中細菌檢測的靈敏度和特異性、為了從食品樣品中分離、濃縮和純化目標細菌，基于適配體的系統(tǒng)已被報道為捕獲目標病原體的可靠方法。適配體是人工合成的寡核苷酸，通過其三維結(jié)構(gòu)和分子間氫鍵結(jié)合到廣泛的靶標上。與傳統(tǒng)抗體相比，適配體具有高選擇性、穩(wěn)定性、多靶標結(jié)合和易于合成的能力，基于以上特性適配體已被廣泛應用于生物檢測和診斷領(lǐng)域。對于單增李斯特菌，已經(jīng)確定了幾種高結(jié)合特異性的核酸適配體，例如靶向李斯特菌溶血素o的llo-3、靶向單增李斯特菌侵襲性蛋白內(nèi)毒素a的npc-aptamer、靶向單增李斯特菌表面的四種適配體lm6-2、lm6-116、lm12-6、lm12-13。基于這些適配體的富集技術(shù)為復雜樣品中目標病原體的分離與檢測提供了新的解決方案。因此需要提供高效、靈敏的單增李斯特菌檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種檢測單增李斯特菌的試劑盒和非診斷目的的檢測方法，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)勢，為食品安全領(lǐng)域提供了低成本、高效的現(xiàn)場檢測方案，同時展現(xiàn)了拓展至其他病原體檢測的潛力。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種捕獲單增李斯特菌的適配體組合，包括lmca2適配體、lmca26適配體和a15適配體；

4、所述lmca2適配體的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、所述lmca26適配體的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

6、所述a15適配體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、本發(fā)明還提供了一種檢測單增李斯特菌的試劑盒，包括適配體功能化磁珠、rpa溶液、crispr/cas12a溶液和cas12a層析試紙條；

8、所述適配體功能化磁珠上負載有上述技術(shù)方案所述的適配體組合；

9、所述rpa溶液的體系為：緩沖液2.95μl、depc水1.12μl、10μm上下游引物各0.24μl、280mm醋酸鎂0.25μl和rpa酶1/10管；

10、所述crispr/cas12a溶液的體系為：12a?buffer?5μl、1μm的lbcas12a蛋白2μl、1μm的crrna2μl、100nm的雙標記探針1μl和depc水15μl。

11、優(yōu)選的，所述適配體功能化磁珠的制備方法包括以下步驟：將適配體溶液變性和冷卻，得到反應液；

12、將所述反應液與鏈霉親和素免疫磁珠混合、孵育，得到適配體功能化磁珠。

13、優(yōu)選的，所述rpa溶液中上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

14、優(yōu)選的，所述crispr/cas12a溶液中crrna的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

15、優(yōu)選的，所述crispr/cas12a溶液中雙標記探針的核苷酸序列為5'-bio-tcccccct-fam-3'。

16、本發(fā)明還提供了一種非診斷和治療目的的單增李斯特菌的檢測方法，包括以下步驟：

17、1)將樣品進行前處理，得到待測樣本；

18、2)將所述步驟1)得到的待測樣本與含有上述技術(shù)方案所述試劑盒中適配體功能化磁珠的溶液混合，孵育后，得到復合體；

19、3)提取所述步驟2)得到的復合體的dna，將所述dna與上述技術(shù)方案所述試劑盒中rpa溶液混合、反應，得到反應物；

20、4)將所述步驟3)得到的反應物與上述技術(shù)方案所述試劑盒中crispr/cas12a溶液混合后繼續(xù)反應，得到繼續(xù)反應物；

21、5)將所述步驟4)得到的繼續(xù)反應物與加樣緩沖液混合后，得到混合液；

22、6)將上述技術(shù)方案所述試劑盒中試紙條放入步驟5)所述混合液中，根據(jù)試紙條上的t線和c線顯色情況，檢測樣品中是否含有單增李斯特菌。

23、優(yōu)選的，所述步驟1)前處理方法包括：將1g樣品加9ml無菌水進行勻漿研磨后，取上清；

24、所述步驟2)待測樣本與含有適配體功能化磁珠的溶液的體積比為1:0.05；所述溶液中適配體功能化磁珠的濃度為10mg/ml；所述孵育的時間為40min，溫度為20～30℃。

25、優(yōu)選的，所述步驟3)dna與rpa溶液的體積比為0.2:4.8；所述反應的溫度為37℃，時間為15min；

26、所述步驟4)crispr/cas12a溶液和rpa溶液的體積比為5:1；所述繼續(xù)反應的溫度為37℃，時間為15min。

27、優(yōu)選的，所述步驟5)加樣緩沖液與crispr/cas12a溶液的體積比為4:5；

28、所述步驟6)試紙條放入混合液的時間為2min。

29、本發(fā)明的有益效果：

30、本發(fā)明開發(fā)了一種利用適配體功能化磁珠和rpa恒溫擴增和crispr/cas12a技術(shù)高效準確檢測單增李斯特菌的方法(lm-cas12a-lfa)。該方法將適配體偶聯(lián)至磁珠上，用于捕獲單增李斯特菌。室溫孵育1h后，捕獲的單增李斯特菌直接用于dna提取。隨后，在37℃下進行rpa-cas12a-lfa反應30min，反應結(jié)果通過試紙條c、t線顯色呈現(xiàn)。該方法可在60min內(nèi)完成細菌基因組提取到檢測結(jié)果讀取，靈敏度達1×10-10ng/μl。在復雜食品樣品環(huán)境下，結(jié)合適配體功能化磁珠富集處理可在2h內(nèi)從加標樣品中檢測出單增李斯特菌，檢測細菌濃度最低為1.35×100cfu/ml。對16份食品樣品進行檢測，結(jié)果顯示該方法的準確性達100％，與qpcr檢測一致，適用于食品中單增李斯特菌的快速篩查與現(xiàn)場檢測。綜上，lm-cas12a-lfa方法高效、靈敏且便捷，為單增李斯特菌的食品安全監(jiān)測提供了可靠工具。

技術(shù)特征：

1.一種捕獲單增李斯特菌的適配體組合，其特征在于，包括lmca2適配體、lmca26適配體和a15適配體；

2.一種檢測單增李斯特菌的試劑盒，其特征在于，包括適配體功能化磁珠、rpa溶液、crispr/cas12a溶液和cas12a層析試紙條；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述適配體功能化磁珠的制備方法包括以下步驟：將適配體溶液變性和冷卻，得到反應液；所述適配體溶液中l(wèi)mca2適配體、lmca26適配體和a15適配體的濃度都為10nm；

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述rpa溶液中上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述crispr/cas12a溶液中crrna的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述crispr/cas12a溶液中雙標記探針的核苷酸序列為5'-bio-tcccccct-fam-3'。

7.一種非診斷和治療目的的單增李斯特菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)前處理方法包括：將1g樣品加9ml無菌水進行勻漿研磨后，取上清；

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟3)dna與rpa溶液的體積比為0.2:4.8；所述反應的溫度為37℃，時間為15min；

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟5)加樣緩沖液與crispr/cas12a溶液的體積比為4:5；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測單增李斯特菌的試劑盒和非診斷目的的檢測方法。本發(fā)明將適配體偶聯(lián)至磁珠上，用于捕獲單增李斯特菌。室溫孵育1h后，捕獲的單增李斯特菌直接用于DNA提取。在37℃下進行RPA?Cas12a?LFA反應30min，反應結(jié)果通過試紙條C、T線顯色呈現(xiàn)。在復雜食品樣品環(huán)境下，結(jié)合適配體功能化磁珠富集處理可在2h內(nèi)從加標樣品中檢測出單增李斯特菌，檢測細菌濃度最低為1.35CFU/mL。對16份食品樣品進行檢測，結(jié)果顯示該方法的準確性達100％，與qPCR檢測一致，適用于食品中單增李斯特菌的快速篩查與現(xiàn)場檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：盧士英,李浩菘,李巖松,上官春逸,王菡,吳宗澄,柳溪林,任洪林,胡盼,王洋
受保護的技術(shù)使用者：吉林大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24