本發明屬于生物醫藥，具體涉及一種細胞條件培養基、抗胰島細胞凋亡的藥物及用途。

背景技術：

1、1型糖尿病的本質是慢性自身免疫反應介導的β細胞破壞，產生胰島素的絕對缺乏和由此導致的高血糖癥。其發病率高且有嚴重并發癥，不僅增加患者病死率，同時給社會帶來很大經濟負擔。目前，1型糖尿病的主要治療方式是皮下注射外源性胰島素，此治療方式雖然能夠控制患者的血糖升高，但難以穩定維持血糖水平穩定，且不能防止和逆轉糖尿病引起的大、微血管病變及其并發癥。2015年，美國臨床胰島移植協會證實了胰島移植是治療1型糖尿病合并低血糖意識不清或嚴重低血糖事件的安全有效的方法，且胰島移植是恢復生理狀態下胰島素的分泌并維持正常血糖水平的最根本的治療方式。目前來看，胰島移植是治療糖尿病最有效的手段之一。據國際胰島移植注冊中心數據表明，大部分移植中心的胰島移植術后5年脫離胰島素比例已超過50%，部分中心達60%以上。盡管在過去二十年中胰島移植療效有了顯著改善，但胰島移植的長期療效仍然不理想，5年胰島素脫離率仍存在較大的提升空間。

2、移植胰島細胞進入體內后會經歷缺氧、即時血液介導的炎癥反應（ibmir）、持續的免疫反應等，進而導致大部分（80%）移植胰島在移植后（24~48h）立即丟失。因此，早期移植胰島大量丟失是降低移植物存活率的重要因素，也是胰島移植廣泛應用于臨床的關鍵問題。如何減輕早期移植胰島的凋亡，提高移植胰島功能，延長移植后完全脫離胰島素時間是目前胰島移植領域亟待解決的重要問題。當前減輕胰島移植凋亡的方法主要有以下幾種：

3、（1）mscs可抑制移植胰島早期凋亡

4、大量研究證實，不同組織來源的間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells，mscs）與胰島細胞聯合培養后可通過調控胰島細胞中凋亡相關因子如bax和bcl-2的表達，從而抑制胰島細胞的早期凋亡。最新研究表明，mscs可通過分泌抗氧化細胞因子抑制活性氧和谷胱甘肽的生成，分泌外泌體和il-6抑制氧化應激相關erk/akt通路的激活；mscs也可激活pi3k/akt/mtor信號通路增加自噬，從而抑制移植胰島的凋亡，提高胰島細胞存活率。然而，一直以來mscs的不定向分化引起的安全性問題飽受爭議，注定了mscs與胰島細胞聯合移植應用于臨床還有很多科學技術難題有待攻克。

5、（2）抗凋亡因子可抑制早期移植胰島凋亡的發生

6、在胰島移植過程中，由外源性刺激啟動的胰島細胞凋亡級聯反應，如即時血液介導的炎癥反應（instant?blood?mediated?immune?reaction，ibmir）和炎癥細胞因子，可被il-1β受體激動劑（阿那白滯素）和tnf-α受體融合蛋白（依那西普）抑制，從而提高胰島細胞存活率。另外，內源性刺激如活性氧和缺氧等，也可誘導胰島細胞凋亡級聯反應的激活，加速移植胰島的早期丟失。新型泛半胱天冬酶抑制劑，如f57318的應用，能夠顯著抑制胰島移植物的凋亡和改善長期療效。然而，這些藥物用于治療的窗口期、在宿主中的穩態、是否對胰島β細胞或血管重建過程具有直接毒性，以及藥物的半衰期和作用的持久性還需進一步的研究。

7、（3）基因治療為預防早期移植胰島的凋亡提供新治療概念

8、在移植前，對分離的胰島細胞進行體外靶基因修飾是抑制胰島細胞凋亡的重要措施之一。胰島細胞是由5種細胞組成的細胞團塊，被稱為具有獨特微血管網絡的微器官。據報道，在胰島細胞中利用不同的基因治療方法（腺病毒、腺相關病毒和慢病毒等）調控凋亡及氧化應激相關基因的表達，如bcl-2、bcl-xl和脂聯素，可提高移植物的存活率。另有研究利用質粒向胰島細胞中轉染vegfa，結果發現vegfa雖然可顯著改善移植胰島早期血管重建水平，但在長期療效中卻發現了血管異常增生導致大量胰島細胞毀損。

9、因此，在胰島移植領域尋找新的安全有效的抑制早期移植胰島凋亡的物質是解決移植胰島長期療效欠佳這一臨床難題的重要途徑和方法。

技術實現思路

1、基于以上技術問題，本發明提供一種細胞條件培養基、抗胰島細胞凋亡的藥物及用途。經試驗證明，細胞條件培養基及其活性成分——鐵負載形式的lcn2蛋白能夠抑制ins-1細胞和原代胰島細胞的凋亡。

2、本發明提供的具體技術方案如下：

3、本發明第一方面，提供一種細胞條件培養基，其是按照以下步驟制備得到的：

4、誘導骨髓間充質干細胞凋亡，將凋亡的骨髓間充質干細胞置于dmem/f12培養基中進行培養20h~30h，所得培養液于2000?rpm~4000?rpm離心10min~15min，收集上清，即為所述細胞條件培養基。

5、作為本發明的一個優選方案，星利用星型孢菌素誘導骨髓間充質干細胞凋亡，星型孢菌素的使用濃度為0.1μm~0.5μm，處理時間為1h~6h。

6、作為本發明的一個優選方案，骨髓間充質干細胞的凋亡程度為20%~60%。

7、本發明第二方面，提供一種體外培養誘導凋亡的骨髓間充質干細胞的試劑盒，其包括所述細胞條件培養基。

8、本發明第三方面，提供一種所述的細胞條件培養基在培養凋亡骨髓間充質干細胞中的用途。

9、本發明第四方面，提供一種所述的細胞條件培養基在制備抗胰島細胞凋亡的藥物中的用途。

10、作為本發明的一個優選方案，所述細胞條件培養基用于制備胰島移植治療糖尿病中抗胰島細胞凋亡的藥物。

11、進一步優選地，所述藥物以所述細胞條件培養基作為唯一有效成分。

12、作為本發明的一個優選方案，所述細胞條件培養基用于制備器官灌洗液或保存液。

13、進一步地，所述細胞條件培養基用于制備胰腺器官灌洗液或保存液。

14、本發明第五方面，提供一種抗胰島細胞凋亡的藥物，其是由所述的細胞條件培養基或所述細胞條件培養基的有效活性成分以及藥學上可接受的輔料或載體復配而成，所述細胞條件培養基的有效活性成分為鐵負載形式的lcn2蛋白。

15、所述藥物可以按照藥學上可接受的方法制備成適宜的藥物制劑，如口服制劑或注射制劑。示例性的，口服制劑如膠囊劑、片劑、顆粒劑等。在具體制備時可選擇加入適宜的輔料或載體，輔料或載體的種類及用量按照所選制劑類型及細胞條件培養基、鐵負載形式的lcn2蛋白的性質來確定。示例性的，可選的輔料可以為混懸劑、助懸劑、潤濕劑、增稠劑、增粘劑、抗氧化劑、包衣材料、矯味劑、著色劑、防腐劑等。

16、相較于現有技術，本發明的有益效果為：

17、本發明借助分泌蛋白和代謝物高通量質譜聯合生物信息學分析，全方面研究誘導凋亡對bmscs旁分泌功能的影響，結合其分泌物的差異分析及其對抑制移植胰島的早期凋亡的影響證實，細胞條件培養基及其有效成分——鐵負載形式的lcn2蛋白holo-lcn2能通過增加細胞內鐵離子濃度抑制ins-1細胞的凋亡，為靶向藥物的研發提供了新的潛在靶點和理論依據。

技術特征：

1.一種細胞條件培養基，其特征在于，其是按照以下步驟制備得到的：

2.根據權利要求1所述的細胞條件培養基，其特征在于，利用星型孢菌素誘導骨髓間充質干細胞凋亡，星型孢菌素的使用濃度為0.1μm~0.5μm，處理時間為1h~6h。

3.根據權利要求2所述的細胞條件培養基，其特征在于，骨髓間充質干細胞的凋亡程度為20%~60%。

4.一種體外培養誘導凋亡的骨髓間充質干細胞的試劑盒，其特征在于，其包括權利要求1所述細胞條件培養基。

5.一種權利要求1所述的細胞條件培養基在培養凋亡骨髓間充質干細胞中的用途。

6.一種權利要求1所述的細胞條件培養基在制備抗胰島細胞凋亡的藥物中的用途。

7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述細胞條件培養基用于制備胰島移植治療糖尿病中抗胰島細胞凋亡的藥物。

8.根據權利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述藥物以所述細胞條件培養基作為唯一有效成分。

9.根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述細胞條件培養基用于制備器官灌洗液或保存液。

10.一種抗胰島細胞凋亡的藥物，其特征在于，其是由權利要求1所述的細胞條件培養基或所述細胞條件培養基的有效活性成分以及藥學上可接受的輔料或載體復配而成，所述細胞條件培養基的有效活性成分為鐵負載形式的lcn2蛋白。

技術總結
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種細胞條件培養基、抗胰島細胞凋亡的藥物及用途。細胞條件培養基是按照以下步驟制備得到：誘導骨髓間充質干細胞凋亡，將凋亡的骨髓間充質干細胞置于DMEM/F12培養基中培養20h~30h，所得培養液于2000?rpm~4000?rpm離心10min~15min，收集上清，即為細胞條件培養基。本發明借助分泌蛋白和代謝物高通量質譜聯合生物信息學分析證實，細胞條件培養基及其活性成分鐵負載形式的LCN2蛋白通過增加細胞內三價鐵離子濃度抑制INS?1細胞的凋亡，為提高胰島移植療效的藥物提供了新的選擇。

技術研發人員：丁小明,路翠楠,王婧雯,王穎,王嘉樂
受保護的技術使用者：西安交通大學醫學院第一附屬醫院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28