本發明涉及生物醫藥，尤其涉及一種靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法與應用。

背景技術：

1、嵌合抗原受體巨噬細胞(car-m)療法是利用基因編輯技術修飾患者的巨噬細胞，賦予其腫瘤細胞特異性清除能力的新型治療方法。相較于已經投入臨床惡性血液腫瘤治療的嵌合抗原受體t細胞(car-t)療法，car-巨噬細胞在實體瘤治療上具有其獨特的優勢，包括良好的穿透浸潤能力、可呈遞抗原激活細胞免疫等，具有更為廣闊的發展前景。然而，單獨的car-m療法對于要克服腫瘤相關巨噬細胞（tam）導致的免疫抑制性腫瘤微環境依然很困難，需要聯合其他藥物共同提高m1型巨噬細胞的抗腫瘤能力。雖然基于第一款靶向her2的car-m療法中顯示巨噬細胞經過腺病毒載體轉導后可使部分m2型巨噬細胞變為m1型，但巨噬細胞的功能也往往同時受到多種信號調節，僅靠自身car的表達是難以克服免疫抑制的。因此，如何調控巨噬細胞在體內的可塑性，使tam重編程為m1型巨噬細胞，逆轉免疫抑制性腫瘤微環境，是提升car-m療效的關鍵。

2、乳腺癌組織高度表達trop2（人滋養細胞表面糖蛋白抗原2），而正常組織幾乎不表達，因此trop2可以作為乳腺癌的特異性標志物以及car-巨噬細胞識別乳腺癌細胞的靶標抗原，構建靶向trop2的car-巨噬細胞將實現對乳腺癌細胞的精準識別和吞噬、并通過抗原遞呈作用激活抗腫瘤免疫應答。許多研究表明將tlr激動劑應用到腫瘤免疫治療中，有望將“冷腫瘤”（即無免疫源性的腫瘤（non-immunogenic?tumor））變“熱”（有免疫源性），解決單免疫檢查點抑制劑應答率低的問題，提高免疫治療效果。這不僅能夠助力巨噬細胞使其復極化，也能夠避免免疫抑制微環境導致的問題。

3、相較于質粒dna，mrna在細胞質內與核糖體結合即可完成編碼蛋白的翻譯，無需進入細胞核、插入基因組，具有更高的翻譯效率和安全性。因此，本發明采用lnp（脂質納米顆粒）共遞送car?mrna與tlr激動劑，在體編輯巨噬細胞原位生成表達trop2的car-巨噬細胞，省略了繁瑣的工程細胞體外制備過程，并規避了免疫細胞系統回輸引發的潛在全身毒副作用。同時lnp釋放的tlr激動劑可使實體瘤內的tam重編程為m1型，刺激nk和t細胞，改變腫瘤免疫抑制微環境，從而達到協同治療實體瘤的目的。

技術實現思路

1、本發明提供一種靶向trop2的嵌合抗原受體（car）巨噬細胞及其制備方法與應用。本發明將mrna和tnp激動劑遞送轉染巨噬細胞，形成car-巨噬細胞，提高car-trop2的抗腫瘤效果。

2、為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下：

3、本發明第一方面，提供一種靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞，所述巨噬細胞含有靶向trop2的特異性car和阻斷免疫抑制信號的阻斷劑；所述靶向乳腺癌的trop2特異性car的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、作為對上述方案的進一步描述：所述靶向trop2的特異性car的mrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、作為優選，所述阻斷免疫抑制信號的阻斷劑為膽固醇-tlr激動劑綴合物。

6、本發明第二方面，還提供一種靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，所述方法包括脂質納米粒的制備步驟以及脂質納米粒轉染巨噬細胞的步驟；

7、所述脂質納米粒的制備步驟如下：

8、步驟(1)將靶向trop2的car的mrna溶于檸檬酸鈉緩沖液中，得到mrna混合液；

9、步驟(2)將可電離脂質sm-102、膽固醇-tlr激動劑綴合物、dmg-peg2000、dspc和dspe-peg-man溶于乙醇中，得到混合脂質溶液；

10、步驟(3)向微流控設備中加入mrna混合液和混合脂質溶液，通過微流控法制備得到共載編碼靶向trop2的特異性car的mrna和膽固醇-tlr激動劑綴合物的脂質納米粒。

11、作為優選，所述膽固醇-tlr激動劑綴合物的合成方法如下：

12、將tlr激動劑r848溶解在有機溶劑中，然后分別加入0.8-1.2摩爾倍數的膽固醇半琥珀酸酯、0.8-1.2摩爾倍數的4-二甲氨基吡啶和0.8-1.2摩爾倍數的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)?碳酰二亞胺；將反應底物在室溫下攪拌20-30h，反應完成后，使用柱色譜純化粗產物，得到膽固醇-tlr激動劑綴合物；

13、所述有機溶劑為乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷或甲醇。

14、作為優選，所述可電離脂質sm-102、膽固醇-tlr激動劑綴合物、dmg-peg2000、dspc和dspe-peg-man的摩爾比為30-60：30-50：1-5：10-20：1-10；所述膽固醇-tlr激動劑綴合物濃度為0.5-1mg/ml。

15、作為優選，步驟（1）中所述mrna混合液中mrna的濃度為3～10μg/ml；

16、所述mrna混合液中的mrna和混合脂質溶液中的可電離脂質sm-102的質量比為1：8-20。

17、作為對上述方案的進一步描述：步驟（3）制備得到的脂質納米粒在體內或者體外轉染巨噬細胞得到靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞。

18、本發明第三方面，還提供所述靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞或所述脂質納米粒在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。作為優選，所述腫瘤為乳腺癌。

19、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明采用lnp共遞送car?mrna與tlr激動劑，在體編輯巨噬細胞原位生成表達trop2的car-巨噬細胞，省略了繁瑣的工程細胞體外制備過程，并規避了免疫細胞系統回輸引發的潛在全身毒副作用。

20、本發明提供的納米遞藥系統具有獨特的優點，首先，本發明采用了在lnp的處方中添加dspe-peg-man（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇甘露糖）以實現對巨噬細胞上的甘露糖受體進行識別和主動靶向。其次，可離子化脂質的加入可促進基因藥物的溶酶體逃逸。此外，將小分子藥物r848與膽固醇綴合后加入lnp系統中，不僅可以調節r848的疏水性，利于其被lnp包裹，還可以避免r848單獨靜脈注射產生的全身毒性。這些設計為聯合藥物發揮協同作用，通過多種機制克服免疫抑制微環境提供了顯著的優勢。

技術特征：

1.一種靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞，其特征在于，所述巨噬細胞含有靶向trop2的特異性car和阻斷免疫抑制信號的阻斷劑；所述靶向乳腺癌的trop2特異性car的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.根據權利要求1所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞，其特征在于，所述靶向trop2的特異性car的mrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.根據權利要求1所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞，其特征在于，所述阻斷免疫抑制信號的阻斷劑為膽固醇-tlr激動劑綴合物。

4.一種根據權利要求2所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括脂質納米粒的制備步驟以及脂質納米粒轉染巨噬細胞的步驟；

5.根據權利要求4所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，所述膽固醇-tlr激動劑綴合物的合成方法如下：

6.根據權利要求4所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，所述可電離脂質sm-102、膽固醇-tlr激動劑綴合物、dmg-peg2000、dspc和dspe-peg-man的摩爾比為30-60：30-50：1-5：10-20：1-10；所述膽固醇-tlr激動劑綴合物濃度為0.5-1mg/ml。

7.根據權利要求4所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述mrna混合液中mrna的濃度為3～10μg/ml；

8.根據權利要求4-7任一所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，步驟（3）制備得到的脂質納米粒在體內或者體外轉染巨噬細胞得到靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞。

9.根據權利要求1所述的靶向trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞，或權利要求4-7任一所述的脂質納米粒在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為乳腺癌。

技術總結
本發明公開了一種靶向Trop2的嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法和應用。所述巨噬細胞含有靶向Trop2的特異性CAR和阻斷免疫抑制信號的阻斷劑；所述靶向乳腺癌的Trop2特異性CAR的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述靶向Trop2的特異性CAR的mRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明采用LNP共遞送CAR?mRNA與TLR激動劑，在體編輯巨噬細胞原位生成表達Trop2的CAR?巨噬細胞，省略了繁瑣的工程細胞體外制備過程，并規避了免疫細胞系統回輸引發的潛在全身毒副作用。

技術研發人員：陳策實,周靖娥,胡藝嚴,李富兵
受保護的技術使用者：昆明醫科大學
技術研發日：
技術公布日：2025/3/10