本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程改造，具體涉及一種高比活海藻酸裂解酶突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、褐藻主要由褐藻膠、昆布多糖、甘露醇和褐藻多糖硫酸酯等組成。其中，褐藻膠是來源于褐藻細胞壁的一種陰離子多糖，是褐藻中主要的結(jié)構(gòu)成分，也稱為海藻酸鈉或褐藻酸鈉。利用褐藻首先要解決利用褐藻膠的問題。
2、褐藻膠的降解方法主要有：（1）化學(xué)降解。酸、水熱或堿預(yù)處理已經(jīng)被用于褐藻膠的水解，化學(xué)降解中酸水解比較常用，但是褐藻膠相對耐酸，并且難以控制糖醛酸生產(chǎn)，另外，需要高濃度的酸來獲得高產(chǎn)率的糖醛酸。（2）水預(yù)熱處理。褐藻膠經(jīng)水熱處理（180-240℃）可產(chǎn)生褐藻膠單體（甘露糖醛酸鹽和古洛糖醛酸鹽），同時產(chǎn)生乳酸和乙醇酸等物質(zhì)。（3）酶法降解。酶法降解海藻酸條件溫和，過程可控，得率高，綠色安全，環(huán)境友好，作用機理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一或組合使用不同底物專一性的酶制劑。內(nèi)切型海藻酸裂解酶產(chǎn)生具有不同dp的褐藻膠寡糖，而外切型酶降解褐藻膠或褐藻膠低聚糖產(chǎn)生單糖。
3、海藻酸裂解酶的生產(chǎn)大多是依靠海藻酸分解菌，雖然野生型海藻酸分解菌能有效的獲得定量的酶蛋白，但產(chǎn)量很低成本較高，難達到實際應(yīng)用要求。因此，利用基因工程手段對海藻酸裂解酶基因進行異源表達是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。研究主要集中在海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因的克隆和在枯草芽孢桿菌中過表達。目前，已有二十多種海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，而且其中大部分基因已成功地進行了異源表達。重組海藻酸裂解酶的表達量均高于野生菌株。根據(jù)cazy數(shù)據(jù)庫的分類，海藻酸裂解酶屬于多糖降解酶（pl），并且具體分為pl5、pl6、pl7、pl14、pl15、pl17、pl18七個家族。
4、近年來，隨著蛋白質(zhì)工程改造技術(shù)在酶制劑領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，新型的酶活水平高、性質(zhì)優(yōu)良的海藻酸裂解酶的開發(fā)成為本領(lǐng)域的研究熱點，對于降低海藻酸裂解酶的生產(chǎn)成本，促進海藻酸裂解酶的產(chǎn)業(yè)化具有重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種海藻酸裂解酶突變體及其應(yīng)用。所述突變體的比活力比野生型得到顯著提高，有利于其在海藻加工等工業(yè)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。
2、本發(fā)明一方面涉及一種海藻酸裂解酶突變體，所述突變體是氨基酸序列為seq?idno:1的海藻酸裂解酶的第15位氨基酸由pro突變?yōu)閏ys。
3、本發(fā)明還涉及編碼上述海藻酸裂解酶突變體的dna分子。
4、本發(fā)明還涉及包含上述dna分子的重組表達質(zhì)粒。
5、本發(fā)明還涉及一種宿主細胞，包含上述重組表達質(zhì)粒。
6、將上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞中，重組表達的海藻酸裂解酶突變體的比活力得到顯著提升。
7、在本發(fā)明的一些實施例中，宿主細胞為枯草芽孢桿菌（ bacillus?subtilis）。
8、與野生型海藻酸裂解酶ah1相比，本發(fā)明提供的p15c單點突變體，在40℃低溫條件下的比活力提高了63.6%，高達228.2u/mg，取得了意料不到的技術(shù)效果。
9、本發(fā)明開發(fā)的海藻酸裂解酶突變體在低溫條件下的比活力得到顯著提高，可廣泛用于海藻加工領(lǐng)域，有效提高馬尾藻、泡葉藻等海藻的酶解效率，市場前景廣闊。
1.一種海藻酸裂解酶突變體，其特征在于，所述突變體是氨基酸序列為seq?id?no:1的海藻酸裂解酶的第15位氨基酸由pro突變?yōu)閏ys。
2.編碼權(quán)利要求1所述海藻酸裂解酶突變體的dna分子。
3.包含權(quán)利要求2所述dna分子的重組表達質(zhì)粒。
4.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞包含權(quán)利要求3所述的重組表達質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌（bacillus?subtilis）。