本發明屬于生物，具體涉及一種基于鏈霉親和素磁珠篩選靶向凝血酶的非天然核酸適配體的方法和應用。

背景技術：

1、核酸適配體（aptamer）是通過指數富集的配體系統進化技術（systematicevolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，selex）篩選得到的一類具有特異性分子識別能力的單鏈dna或rna分子，相較于傳統抗體，適配體具有易合成、易修飾、穩定性高、無免疫原性等優點，因此，在生物醫學檢測、疾病診斷、藥物遞送等領域具有廣泛的應用前景。然而，天然核酸適配體在實際應用中存在一些局限性。首先，天然dna或rna在生物體內容易被核酸酶降解，導致其在體內的半衰期較短，限制了其在體內的應用；其次，天然核酸適配體的穩定性和親和力可能不足以滿足某些高靈敏檢測的需求；為了解決這些問題，研究人員通常會對適配體進行化學修飾，以提高其穩定性和親和力，然而，化學修飾可能會改變適配體的結構，從而影響其與靶標分子的結合能力。

2、近年來，非天然核酸（如化學修飾的核苷酸）的引入為適配體篩選提供了新的思路。非天然核酸具有更好的生物穩定性和化學多樣性，能夠顯著提高適配體的穩定性和親和力。因此，直接篩選含有非天然核酸的適配體成為一種有效的方法，尤其是在需要高穩定性和高親和力的應用場景中。凝血酶（thrombin）是一種絲氨酸蛋白酶，在血液凝固過程中起著關鍵作用，此外，凝血酶還作為一種重要的細胞外信號分子，通過激活凝血酶受體參與多種病理過程，如急性白血病的發生和發展。急性白血病是一種血液系統常見的惡性腫瘤，病情發展迅速，若不及時治療，可能在短期內危及生命。目前，臨床主要采用骨髓細胞形態學檢查來評估急性白血病的病情進展和治療效果，但這種方法屬于有創檢查，可能會導致患者二次感染。因此，開發一種高靈敏、無創的凝血酶檢測方法對于急性白血病的早期診斷和治療具有重要意義。傳統的凝血酶檢測方法通常依賴于抗體，但抗體的制備成本高、穩定性差，且可能存在免疫原性問題。相比之下，核酸適配體具有易合成、易修飾、穩定性高等優點，能夠作為一種理想的替代品用于凝血酶的檢測。然而，天然核酸在體內的穩定性和作用時間較短，限制了其臨床應用。非天然核酸是通過對核酸分子上的堿基或骨架修飾而獲得，它是天然dna和rna的合成替代物。與天然的dna或rna適配體相比，非天然核酸適配體具有更強的穩定性以及耐核酸酶降解能力。因此在實際運用場景中具有更高的穩定性和更廣泛的應用性。

技術實現思路

1、針對現有非天然核酸適配體篩選方法在含有非天然核酸文庫制備過程中不易被天然存在的聚合酶識別，需要定向進化非天然核酸酶存在的耗時長、成本高等問題，本發明旨在于提供一種基于鏈霉親和素磁珠篩選非天然核酸適配體的方法及應用。

2、為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

3、本發明提供一種基于鏈霉親和素磁珠篩選靶向凝血酶的非天然核酸適配體的方法，包括：

4、s1，合成初始dna分子隨機文庫和引物；

5、s2，基于初始dna分子隨機文庫，利用聚合酶以dt、dc、dg、a*四種核苷三磷酸單體為底物進行引物延伸反應，獲得單鏈非天然核酸文庫；

6、s3，基于單鏈非天然核酸文庫，與未結合凝血酶的羧基磁珠孵育，進行反向篩選，分離未結合磁珠的非天然核酸文庫，獲得反篩后的非天然核酸文庫；

7、s4，基于反篩后的非天然核酸文庫，與偶聯有凝血酶的鏈霉親和素磁珠孵育，分離結合在磁珠上的核酸溶液，逆轉錄，pcr擴增，分離單鏈dna獲得第一輪篩選富集文庫；

8、s5，基于第一輪富集文庫，重復s1~s4進行多輪篩選，對最后一輪篩選富集文庫測序，獲得非天然核酸分子序列信息，制備單鏈非天然核酸分子，即為潛在非天然核酸適配體。

9、所述合成初始dna分子隨機文庫和引物，合成初始dna分子隨機文庫的dna模板序列如seq?id?no.1所示。

10、進一步地，所述初始dna分子隨機文庫核酸序列：5’-biotin--ctatagcaatggtacggtacttcc- n40-caaaagtgcacgctactttgctaa-3’（如seq?id?no.1所示），其中， n40代表隨機核酸序列，用于生成多樣化的dna分子文庫，序列的兩端是固定的引物結合區域，用于后續的pcr擴增，5’端標記有生物素（biotin）。

11、所述引物包括上游引物和下游引物，序列如seq?id?no.2~seq?id?no.3所示。

12、進一步地，上游引物核酸序列：5’-biotin-ctatagcaatggtacggtacttcc-3’（如seqid?no.2所示），與dna模板序列的5’端固定區域互補，用于引導pcr擴增?；下游引物核酸序列：5’-fam-ttagcaaagtagcgtgcacttttg-3’（如seq?id?no.3所示）與dna模板序列的3’端固定區域互補，用于pcr擴增的另一條鏈，5’端標記有fam（熒光素）。

13、所述引物延伸反應條件為：反應緩沖液為therminator酶反應緩沖液，反應溫度為36~38?°c，反應時間為1~2?h。

14、進一步地，所述引物延伸反應條件為：反應溫度為37?°c，反應時間為2?h。

15、所述四種dt、dc、dg、a*的核苷三磷酸單體的比例為1:1:1:30~20。

16、進一步地，所述四種dt、dc、dg、a*的核苷三磷酸單體的比例為1:1:1:10。

17、s3中，所述孵育條件為：室溫孵育1~2?h。

18、s4中，所述偶聯有凝血酶的鏈霉親和素磁珠采用如下步驟獲得：使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和 n-羥基琥珀酰亞胺活化磁珠；將活化后的磁珠與凝血酶溶液孵育，偶聯凝血酶；使用乙醇胺封閉未反應的活性位點。

19、進一步地，所述活化后的磁珠與凝血酶溶液孵育條件為：室溫孵育1~2?h。

20、s4中，所述pcr擴增條件為：95?°c預變性5分鐘；95?°c變性10秒，55?°c退火10秒，72?°c延伸30秒，70?°c延伸5分鐘，25～35個循環。

21、s5中，所述多輪篩選為5~10輪篩選。

22、上述的基于鏈霉親和素磁珠篩選非天然核酸適配體的方法，還包括測試非天然核酸分子與靶蛋白的親和力步驟，對非天然核酸適配體二級結構預測并通過實驗驗證其親和力步驟。

23、上述的方法獲得的靶向凝血酶的非天然核酸適配體。

24、進一步地，所述靶向凝血酶的非天然核酸適配體的序列如seq?id?no.4所示。

25、上述的方法在篩選靶向蛋白的非天然核酸適配體中的應用，所述靶向蛋白為sars-cov-2核衣殼蛋白、腫瘤壞死因子相關的ox40蛋白、lag-3免疫檢查點蛋白cd223中的任意一種。

26、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

27、本發明提供的一種基于鏈霉親和素磁珠篩選靶向凝血酶的非天然核酸適配體的方法，利用聚合酶以dt、dc、dg、a*（其中a*代表一種非天然核苷三磷酸單體）四種核苷三磷酸單體為底物，在初始dna分子隨機文庫的基礎上生成了大量的單鏈非天然核酸分子，引入非天然核苷三磷酸單體a*，引物延伸反應能夠在生成的核酸分子中引入非天然元素，非天然元素賦予核酸分子新的化學和生物學性質，從而增加其作為適配體的潛力和特異性，為后續的篩選提供了豐富的候選分子；通過鏈霉親和素磁珠與生物素化凝血酶的結合，實現了對凝血酶的高特異性識別，提高了篩選的特異性和效率，縮短了篩選周期，減少了操作步驟，降低了篩選成本；通過多輪的正向和反向篩選，該方法不斷富集那些與凝血酶具有高親和力的核酸適配體，能夠在較低的濃度下與凝血酶有效結合，從而提高了檢測的靈敏度；篩選出的非天然核酸適配體具有良好的親和力和穩定性，克服了天然核酸適配體在生物體內易被核酸酶降解、生物穩定性較差的缺陷，有利于提高適配體在生物醫學領域的應用效果；可用于凝血酶的高靈敏檢測，對于醫學臨床診斷具有重要意義，有利于提高惡性腫瘤等疾病的早期診斷和預后判斷的準確性。

28、進一步地，通過引入隨機序列區域，生成了大量的具有不同序列的dna分子，這種多樣性為后續的核酸適配體篩選提供了豐富的候選分子，增加了篩選到高特異性、高親和力適配體的可能性，調整dna模板序列中的隨機序列區域長度和引物序列，可以生成具有特定性質的dna分子隨機文庫；通過引入非天然核酸殘基，拓寬了適配體的設計空間，使得篩選出的適配體在保持高特異性的同時，還具有更好的生物穩定性和與目標分子的親和力；通過鏈霉親和素磁珠的反向篩選和正向篩選相結合的方法，能夠高效地從包含非天然核酸殘基的文庫中篩選出與靶標凝血酶蛋白具有高親和力的非天然核酸適配體；多輪篩選進一步提高了篩選的精確度和效率，確保最終獲得的適配體具有高度的特異性和親和力。

29、本發明通過鏈霉親和素磁珠篩選得到的靶向凝血酶的非天然核酸適配體，篩選得到的非天然核酸適配體具有與凝血酶高親和力的結合能力，能夠在較低的濃度下實現有效的結合，為凝血酶的檢測和應用提供了更為靈敏和高效的工具；能夠有效區分凝血酶與其他相似或相關的蛋白質，減少非特異性結合，提高檢測的準確性和可靠性；具有更好的穩定性，能夠抵抗酶解、熱變性等不利因素的影響，延長其使用壽命和應用范圍，相比于傳統核酸適配體，非天然核酸適配體通過引入非天然核苷或化學修飾，提高了其抵抗核酸酶降解的能力；具有更廣泛的應用前景，如在生物傳感、藥物遞送、疾病診斷等領域發揮更為重要的作用。

30、本發明提供的方法在篩選靶向蛋白的非天然核酸適配體中的應用，該方法通過引入非天然核苷，該方法能夠顯著提高核酸適配體的穩定性、親和力和其他功能特性，該方法基于體外篩選技術，具有高效、快速、可重復等優點，不僅適用于凝血酶等小分子靶標，也適用于其他類型的靶向蛋白，包括大分子蛋白質、酶、受體等，篩選出的非天然核酸適配體在生物傳感、疾病診斷、藥物開發等領域具有廣泛的應用前景，對于開發具有實際應用價值的核酸適配體藥物具有重要意義。