本發(fā)明涉及嵌合抗原受體治療領(lǐng)域，具體涉及抗間皮素納米抗體嵌合抗原受體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、間皮素(msln)基因位于染色體1p13.3，全長8kd。該基因包含有1884bp的開放閱讀框，編碼17個外顯子，628個氨基酸。msln的前體蛋白是長約69kd的以糖基磷脂肽肌醇錨定在細(xì)胞膜上的糖蛋白，可以被蛋白水解酶水解成2部分，其中n端為31kd的可溶性蛋白，具有巨核細(xì)胞刺激活性，被稱為巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子(megakaryocyte?potentiating?factor，mpf)；而c端為長約40kd的膜結(jié)合蛋白，具有細(xì)胞黏附性，被稱為msln。msln在膜蛋白的結(jié)構(gòu)可以分為三個不同區(qū)段，其中ⅰ區(qū)為配體ca125的結(jié)合位置。

2、間皮素作為一種分化抗原在多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該靶點是最具有潛力的抗腫瘤靶點之一，已有眾多大型藥企瞄準(zhǔn)該靶點進(jìn)行開發(fā)，目前進(jìn)入臨床試驗的藥物形式包括car-t、單抗、adc等。在過去近20年里，開發(fā)了多種抗間皮素的單克隆抗體，主要包括ss1p免疫毒素和morab-009。ss1p是重組的免疫毒素，由scfv與截短的假胞外菌毒素融合組成，主要介導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用；morab-009是由ss1p序列重組的igg1抗體，主要引起抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(adcc)。

3、ss1p抗體結(jié)合在間皮素ⅰ區(qū)，并且可以阻斷ca125和間皮素的結(jié)合。該抗體也被用于car-t的治療，但療效均不理想(jiang,h.等，protein?cell?8,926–931，2017；adusumilli,p.s.等，sci.transl.med.6,261ra151，2014；lanitis,e.等，mol.ther.20,633–643，2012)。納米抗體具有穩(wěn)定性高、穿透力強(qiáng)、結(jié)合表位廣的天然優(yōu)勢(muyldermanss.annu?rev?biochem.2013；82:775-97.)。本領(lǐng)域尚無將msln納米抗體用于car-t的治療的報道。

4、目前，雖然car-t療法在治療血液瘤上取得了巨大的成效，但在針對實體瘤方面的響應(yīng)率較低。car-t療法聯(lián)合pd-1抑制劑是治療實體瘤新興療法。美國紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心(memorial?sloan?ketteringcancer?center)的研究人員構(gòu)建了一種可以分泌抗pd-1單鏈抗體(scfv)的car-t細(xì)胞(sarwish?rafiq等，nat?biotechnol2018oct；36(9):847-856)。但研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的scfv抗體在t細(xì)胞中表達(dá)量低，難以充分發(fā)揮pd-1抑制劑的效果，這主要是由于scfv抗體本身易聚集、折疊易錯配、熱穩(wěn)定性低等性質(zhì)導(dǎo)致的(martin?n等，macromol?biosci.2017feb；17(2))。而納米抗體則具有易表達(dá)、穩(wěn)定性高、親和力高等天然優(yōu)勢。根據(jù)納米抗體自身優(yōu)勢、msln和pd-1生物學(xué)機(jī)制，開發(fā)一種基于msln納米抗體的car-t，以及同時聯(lián)合自分泌pd-1納米抗體的療法，已經(jīng)成為亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文一方面提供一種嵌合抗原受體，包含任選的信號肽序列、含抗間皮素單域抗體的間皮素結(jié)合分子、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。

2、在一個或多個實施方案中，胞內(nèi)區(qū)包括胞內(nèi)共刺激域和/或胞內(nèi)信號域。

3、在一個或多個實施方案中，所述抗間皮素單域抗體是間皮素iii區(qū)(近膜端)的特異性單域抗體。

4、在一個或多個實施方案中，所述抗間皮素單域抗體包含cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1包括seq?id?no:1所示的序列、cdr2包括seq?id?no:2所示的序列、和cdr3包括seq?idno:3所示的序列。

5、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體的cdr1包含seq?id?no:4-27、73中任一所示的序列。優(yōu)選地，該cdr1包含seq?id?no:5、11、14、15、17、21、27、73中任一所示的序列。

6、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體的cdr2包含seq?id?no:28-47、74中任一所示的序列。優(yōu)選地，該cdr2包含seq?id?no:29、35、37、38、39、43、40、74中任一所示的序列。

7、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體的cdr3包含seq?id?no:48-72、75中任一所示的序列。優(yōu)選地，該cdr3包含seq?id?no:49、55、58、59、61、65、72、75中任一所示的序列。

8、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體的fr區(qū)為選自seq?id?no:76-120的任一vhh的fr區(qū)。

9、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體vhh如seq?id?no:73-120中任一所示。優(yōu)選地，所述抗間皮素單域抗體如seq?id?no:77、83、85、86、87、89、93、100、103中任一所示。

10、在一個或多個實施方案中，所述間皮素結(jié)合分子是包含一條、兩條或多條所述單域抗體的單價或多價單域抗體、多特異性單域抗體、重鏈抗體或其抗原結(jié)合片段、抗體或其抗原結(jié)合片段。

11、在一個或多個實施方案中，從n端到c端，該嵌合抗原受體依次含有信號肽、包含抗間皮素單域抗體的間皮素結(jié)合分子、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)共刺激域和胞內(nèi)信號域。

12、在一個或多個實施方案中，所述信號肽為cd8信號肽、cd28信號肽、cd4信號肽或輕鏈信號肽；更優(yōu)選地為cd8信號肽；優(yōu)選地，所述cd8信號肽的氨基酸序列如seq?id?no:121第1-22位氨基酸殘基所示。

13、在一個或多個實施方案中，所述鉸鏈區(qū)選自cd8鉸鏈區(qū)、igd鉸鏈區(qū)、igg1?fcch2ch3鉸鏈區(qū)和igg4?fc?ch2ch3鉸鏈區(qū)；優(yōu)選地，所述鉸鏈區(qū)是cd8鉸鏈區(qū)；更優(yōu)選地，所述cd8鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:121第149-203位氨基酸殘基所示。

14、在一個或多個實施方案中，所述跨膜區(qū)為cd28跨膜區(qū)、cd8跨膜區(qū)、cd3ζ跨膜區(qū)、cd134跨膜區(qū)、cd137跨膜區(qū)、icos跨膜區(qū)和dap10跨膜區(qū)中的一種；優(yōu)選為cd28跨膜區(qū)，更優(yōu)選其氨基酸序列如seq?id?no:121第204-231位氨基酸殘基所示。

15、在一個或多個實施方案中，所述胞內(nèi)共刺激域包括共刺激信號分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，包括cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶、誘導(dǎo)性t細(xì)胞共刺激因子(icos)和dnax激活蛋白10的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述胞內(nèi)共刺激域為cd28的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述cd28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no:121第231-272位氨基酸殘基所示。

16、在一個或多個實施方案中，所述胞內(nèi)信號域為cd3ζ胞內(nèi)信號域或fcεriγ胞內(nèi)信號域；優(yōu)選為cd3ζ胞內(nèi)信號域，優(yōu)選地所述cd3ζ胞內(nèi)信號域的氨基酸序列如seq?id?no:121第273-384位氨基酸殘基所述。

17、在一個或多個實施方案中，所述嵌合抗原受體從n端到c端依次含有cd8信號肽、抗msln納米抗體、cd8鉸鏈區(qū)、cd28跨膜區(qū)、cd28共刺激域、cd3ζ胞內(nèi)信號域。

18、在一個或多個實施方案中，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如seq?id?no:121或122或123所示。

19、本發(fā)明還提供一種嵌合抗原受體，其抗原結(jié)合域包含抗間皮素單域抗體。

20、在一個或多個實施方案中，抗間皮素單域抗體可以如上述任一方案所述。

21、本發(fā)明還提供核酸分子，包含選自以下的序列：

22、(1)本文任一實施方案所述嵌合抗原受體的編碼序列；

23、(2)(1)的互補(bǔ)序列；

24、(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。

25、在一個或多個實施方案中，所述片段是引物。

26、在一個或多個實施方案中，所述編碼序列是dna或rna。

27、本發(fā)明第二方面還提供核酸構(gòu)建物，其包含本發(fā)明任一實施方案所述的核酸分子。

28、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物還包含pd-1結(jié)合分子的編碼序列。

29、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)座酶的編碼序列和/或pd-1結(jié)合分子的編碼序列，所述轉(zhuǎn)座酶用于轉(zhuǎn)座嵌合抗原受體和/或pd-1結(jié)合分子的編碼序列，例如將轉(zhuǎn)座嵌合抗原受體和/或pd-1結(jié)合分子的編碼序列或表達(dá)框整合到基因組中。

30、在一個或多個實施方案中，轉(zhuǎn)座酶的編碼序列是dna或rna。

31、在一個或多個實施方案中，pd-1結(jié)合分子的編碼序列是dna或rna。

32、在一個或多個實施方案中，pd-1結(jié)合分子包括：pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段，pd-1重鏈抗體或其抗原結(jié)合片段，包含一條、兩條或多條pd-1單域抗體的單價或多價單域抗體、多特異性單域抗體。

33、在一個或多個實施方案中，所述pd-1結(jié)合分子(例如pd-1單域抗體)還包含fc區(qū)域。優(yōu)選地，fc區(qū)域是igg4的fc區(qū)域，序列如seq?id?no:133所示。

34、在一個或多個實施方案中，核酸構(gòu)建物是載體，例如克隆載體、表達(dá)載體或整合載體。

35、在一個或多個實施方案中，所述表達(dá)載體是組成型表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述組成型表達(dá)載體是轉(zhuǎn)座載體。

36、在一個或多個實施方案中，嵌合抗原受體的編碼序列位于所述轉(zhuǎn)座酶的識別序列之間。

37、在一個或多個實施方案中，pd-1結(jié)合分子的編碼序列位于所述轉(zhuǎn)座酶的識別序列之間。

38、在一個或多個實施方案中，所述轉(zhuǎn)座酶是piggybac轉(zhuǎn)座酶(pb酶)。

39、在一個或多個實施方案中，所述轉(zhuǎn)座酶如cn105154473a中所述。

40、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物包含car的表達(dá)框。在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框和/或pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框。所述一種、兩種或三種表達(dá)框包含在一個或多個載體中。

41、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物含有所述嵌合抗原受體的表達(dá)框和所述轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框；或所述核酸構(gòu)建物為一表達(dá)框，其中所述嵌合抗原受體的編碼序列和所述轉(zhuǎn)座酶的編碼序列處于該表達(dá)框內(nèi)。

42、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物含有所述嵌合抗原受體的表達(dá)框和所述pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框；或所述核酸構(gòu)建物為一表達(dá)框，其中所述嵌合抗原受體的編碼序列和所述pd-1結(jié)合分子的編碼序列處于該表達(dá)框內(nèi)。

43、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物含有所述嵌合抗原受體的表達(dá)框、所述轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框和所述pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框；或所述核酸構(gòu)建物為兩表達(dá)框，其一包含所述嵌合抗原受體的編碼序列、所述轉(zhuǎn)座酶的編碼序列和所述pd-1結(jié)合分子的編碼序列的任一，另一包含其余的編碼序列；或所述核酸構(gòu)建物為一表達(dá)框，其中所述嵌合抗原受體的編碼序列、所述轉(zhuǎn)座酶的編碼序列、所述pd-1結(jié)合分子的編碼序列處于該表達(dá)框內(nèi)。

44、在一個或多個實施方案中，核酸構(gòu)建物是一個或多個載體，各載體包含一個或兩個或三個本文任一實施方案中所述的表達(dá)框。

45、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物包含：

46、一種載體，其包含(a)car的表達(dá)框和任選的(b)轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框和/或pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框；

47、兩種載體，其中，所述兩種載體(a)分別包含car的表達(dá)框和pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框，任選地，所述兩種載體中任一還包含轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框，或者(b)一種包含轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框，另一種包含car的表達(dá)框和pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框；

48、三種載體，其分別包含car的表達(dá)框、pd-1結(jié)合分子的表達(dá)框和轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)框。

49、本發(fā)明另一方面提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞：

50、(1)包含和/或表達(dá)本文任一實施方案中所述的嵌合抗原受體，和/或任選包含、表達(dá)和/或分泌pd-1結(jié)合分子，和/或

51、(2)包含本文所述的核酸分子和/或核酸構(gòu)建物。

52、所述轉(zhuǎn)座酶和pd-1結(jié)合分子如本文第二方面中所述。

53、在一個或多個實施方案中，所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞，優(yōu)選t細(xì)胞。

54、在一個或多個實施方案中，所述細(xì)胞含有：(a)本文任一實施方案中所述的嵌合抗原受體的編碼序列；任選含有(b)本文任一實施方案中所述的pd-1結(jié)合分子的編碼序列。

55、在一個或多個實施方案中，所述細(xì)胞含有：本文任一實施方案中所述的嵌合抗原受體的編碼序列和本文任一實施方案中所述的pd-1結(jié)合分子的編碼序列。

56、本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，含有藥學(xué)上可接受的輔料和：

57、(1)本文任一實施方案所述的嵌合抗原受體和/或其編碼序列，任選還包含(i)轉(zhuǎn)座酶和/或其編碼序列，和/或(ii)pd-1結(jié)合分子和/或其編碼序列，或

58、(2)本文任一實施方案所述的核酸分子、核酸構(gòu)建物或細(xì)胞。

59、所述轉(zhuǎn)座酶和pd-1結(jié)合分子如本文第二方面中所述。

60、在一個或多個實施方案中，所述藥物組合物用于治療癌癥。

61、在一個或多個實施方案中，所述癌癥包括間皮素介導(dǎo)的癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥還包括pd-1介導(dǎo)的癌癥。

62、在一個或多個實施方案中，所述癌癥包括選自間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌、腎細(xì)胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤中的一種或多種。

63、本發(fā)明另一方面提供試劑在制備活化的免疫細(xì)胞(例如t細(xì)胞)中的應(yīng)用，所述試劑含有：

64、(1)本文任一實施方案所述的嵌合抗原受體和/或其編碼序列，任選還包含(i)轉(zhuǎn)座酶和/或其編碼序列，和/或(ii)pd-1結(jié)合分子和/或其編碼序列，或

65、(2)本文任一實施方案所述的核酸分子、核酸構(gòu)建物或細(xì)胞。

66、所述轉(zhuǎn)座酶和pd-1結(jié)合分子如本文第二方面中所述。

67、本發(fā)明另一方面提供試劑在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述試劑含有：

68、(1)本文任一實施方案所述的嵌合抗原受體和/或其編碼序列，任選還包含(i)轉(zhuǎn)座酶和/或其編碼序列，和/或(ii)pd-1結(jié)合分子和/或其編碼序列，或

69、(2)本文任一實施方案所述的核酸分子、核酸構(gòu)建物或細(xì)胞。

70、所述轉(zhuǎn)座酶和pd-1結(jié)合分子如本文第二方面中所述。

71、在一個或多個實施方案中，所述癌癥包括間皮素介導(dǎo)的癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥還包括pd-1介導(dǎo)的癌癥。

72、在一個或多個實施方案中，所述癌癥包括選自間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌、腎細(xì)胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤中的一種或多種。

73、本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給予需要的患者治療有效量的本發(fā)明任一實施方案所述的細(xì)胞或藥物組合物。

74、在一個或多個實施方案中，所述癌癥包括間皮素介導(dǎo)的癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥還包括pd-1介導(dǎo)的癌癥。

75、在一個或多個實施方案中，所述癌癥是間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌、腎細(xì)胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。

76、在一個或多個實施方案中，所述治療有效量是為1-100*106個細(xì)胞/鼠，優(yōu)選5*106個細(xì)胞/鼠。

77、在一個或多個實施方案中，細(xì)胞或藥物組合物通過靜脈注射給予。