本發明屬于生物醫學，具體涉及一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測引物、試劑盒及其應用。

背景技術：

1、人類白細胞抗原(human?leukocyteantigen，hla)是人體內一種重要的抗原系統，位于6號染色體斷臂，主要負責識別和呈遞外來抗原，從而啟動免疫反應，是目前人類最復雜的遺傳多態性系統。hla根據編碼蛋白的結構特點分為i類和ii類，hla-a是經典的hlai類位點，多樣性豐富，在實體器官移植或造血干細胞移植中均有重要的臨床意義。hla-a等位基因不匹配有可能導致嚴重的移植物抗宿主病或移植排斥等其他影響患者預后和生存的不良反應，因此移植前供受者hla-a基因高分辨分型檢測是減少不良反應、提升治療效果的重要手段。

2、在采用sanger法一代測序技術(sbt)或寡聚核苷酸探針雜交(sso)進行hla基因分型檢測時，當遇到hla-a*24:02:01g(包括hla-a*24:02或hla-a*24:353)的結果時，由于hla-a*24:02和hla-a*24:353只在第6外顯子1018堿基處存在一個差異堿基，sbt或sso都無法對其進行精準判定，需要通過序列特異性引物擴增(ssp)和核酸電泳加以區分。雖然，下一代測序技術(ngs)的發展和應用已經能夠通過全長測序解決這一問題，但該方法耗時較長，需要48-72小時才能出結果。當臨床上遇到加急樣本時，經常要求在24小時內出具檢測報告，此種情況下，仍需采用耗時較短的sbt或者sso。然而，這兩種技術目前都無法區分a*24:02/a*24:353的情況，需要借助ssp擴增和核酸電泳做最后判定。核酸電泳涉及制膠、點樣、電泳和凝膠成像等環節，需要具備制膠工具、電泳儀、成像儀等多個設備，步驟繁瑣、設備要求高的同時還會引入一些不穩定因素(包括瓊脂糖濃度、熒光染料強度、電泳條件等)，可能對結果判定造成影響。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明的目的在于提供一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測引物，屬于熒光定量pcr擴增用引物，根據擴增曲線和有無ct值進行hla-a*24:02和hla-a*24:353等位基因的判定，實現快速便捷的檢測目的。

2、本發明提供了一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測引物，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:2所示的反向引物。

3、本發明提供了一種基于熒光定量pcr技術快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測試劑盒，包括所述檢測引物。

4、優選的，所述檢測試劑盒還包括sybr?green?mix。

5、優選的，還包括樣本基因組dna提取試劑。

6、本發明提供了所述檢測引物在制備快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因檢測試劑盒中的應用。

7、本發明提供了一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測方法，包括以下步驟：

8、以待測樣本的基因組dna為模板，利用所述檢測引物配置反應體系，進行qpcr檢測，根據待測樣本的擴增曲線和有無ct值判斷樣本的分型結果：

9、當待測樣本有擴增曲線，且ct值≤40時，待測樣本中含hla-a*24:353等位基因；

10、當待測樣本無擴增曲線，且ct值＞40時，待測樣本中含hla-a*24:02等位基因。

11、優選的，所述反應體系為10μl，具體包括sybr?green?mix?5μl、20μm上游引物0.5μl、20μm下游引物0.5μl、基因組dna2μl和ddh2o?2μl。

12、優選的，所述基因組dna的濃度為25～200ng/μl；所述基因組dna的od260/od280為1.65～1.8。

13、優選的，所述qpcr檢測的反應程序為95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃45s，40個循環；72℃2min。

14、優選的，所述待測樣本包括以下至少一種：血液、組織液和分泌液。

15、本發明提供的快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測引物，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:2所示的反向引物。本發明基于熒光定量pcr技術的擴增引物設計原則設計得到一組特異性檢測引物，該引物可以根據擴增曲線和有無ct值進行hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的判定。本發明技術方案克服了現有ssp方法需要通過pcr擴增和核酸電泳才能區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的現狀，使檢測快速便捷。本發明試劑盒使用簡單、準確性高、過程可監控、結果快速，而且無電泳過程，利于臨床的推廣普及。

16、本發明提供了一種基于熒光定量pcr技術快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測試劑盒，包括所述檢測引物。本發明采用熒光定量pcr技術來進行hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的判定，可以根據擴增曲線和有無ct值直接判讀樣本的分型結果。本發明所述試劑盒克服了現有ssp方法需要通過pcr擴增和核酸電泳才能區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的現狀，使檢測快速便捷。

技術特征：

1.一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測引物，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:2所示的反向引物。

2.一種基于熒光定量pcr技術快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述檢測引物。

3.根據權利要求2所述檢測試劑盒，其特征在于，還包括sybr?green?mix。

4.根據權利要求2或3所述檢測試劑盒，其特征在于，還包括樣本基因組dna提取試劑。

5.權利要求1所述檢測引物在制備快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因檢測試劑盒中的應用。

6.一種快速區分hla-a*24:02/hla-a*24:353等位基因的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于，所述反應體系為10μl，具體包括sybrgreen?mix?5μl、20μm上游引物0.5μl、20μm下游引物0.5μl、基因組dna2μl和ddh2o?2μl。

8.根據權利要求7所述檢測方法，其特征在于，所述基因組dna的濃度為25～200ng/μl；所述基因組dna的od260/od280為1.65～1.8。

9.根據權利要求6所述檢測方法，其特征在于，所述qpcr檢測的反應程序為95℃2min；95℃15s，55℃15s，72℃45s，40個循環；72℃2min。

10.根據權利要求5～9中任意一項所述檢測方法，其特征在于，所述待測樣本包括以下至少一種：血液、組織液和分泌液。

技術總結
本發明提供了一種快速區分HLA?A*24:02/HLA?A*24:353等位基因的檢測引物、試劑盒及其應用，屬于生物醫學技術領域。一種區分HLA?A*24:02/HLA?A*24:353等位基因的檢測引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示。本發明采用熒光定量PCR方法進行HLA?A*24:02/HLA?A*24:353等位基因的區分，可以根據擴增曲線和有無Ct值直接判讀樣本的分型結果。本發明試劑盒克服了現有SSP方法需要通過PCR擴增和核酸電泳才能區分HLA?A*24:02/HLA?A*24:353等位基因的現狀，使檢測快速便捷。

技術研發人員：劉潔,鄒紅巖,全湛柔,楊冰娜,宋嘉敏
受保護的技術使用者：深圳市血液中心（深圳市輸血醫學研究所）
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24