本發(fā)明屬于生物，涉及改造的尿酸氧化酶，特別涉及一種具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體。

背景技術(shù)：

1、高尿酸血癥及痛風(fēng)的臨床治療藥物主要為別嘌呤醇（allopurinol）、黃嘌呤氧化酶抑制劑（xanthine?oxidase?inhibitors）、苯溴馬隆、丙磺舒以及秋水仙堿（colchicine）等。這些藥物普遍存在多臟器毒性風(fēng)險，其應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。尿酸氧化酶作為嘌呤代謝終末環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化尿酸轉(zhuǎn)化為溶解性更高的尿囊素（allantoin），展現(xiàn)出更理想的降尿酸作用。目前在臨床上批準(zhǔn)用于高尿酸血癥治療的重組尿酸氧化酶主要來源于異源物種，如黃曲霉（aspergillus?flavus）和豬-狒狒嵌合體，因異源性常引起患者嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。盡管經(jīng)過聚乙二醇（peg）修飾的尿酸氧化酶在半衰期和穩(wěn)定性方面有所提升，患者仍可能產(chǎn)生抗藥物抗體（anti-drug?antibodies，adas）以及輸液反應(yīng)，從而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，故主要用于治療急癥性的、嚴(yán)重的、危及生命的難治性高尿酸血癥。免疫原性的存在已成為尿酸氧化酶在應(yīng)用上的主要限制。開發(fā)具有低免疫原性的尿酸氧化酶成為了當(dāng)前重組尿酸氧化酶改造研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

2、人類尿酸氧化酶基因在進(jìn)化過程中由于復(fù)雜的錯義突變及積累，使其成為假基因，雖然在人的汗腺中發(fā)現(xiàn)尿酸氧化酶的短肽，但并無尿酸氧化酶的活性。jiang等人報(bào)道通過復(fù)活人源尿酸氧化酶假基因獲得低免疫原性治療用尿酸氧化酶（文獻(xiàn)1：jiang?n,?xuc,?zhang?l,?et?al.?“resurrected”?human-source?urate?oxidase?with?highuricolytic?activity?and?stability?[j].?enzyme?and?microbial?technology,?2021,149:?109852.）。該文獻(xiàn)顯示，通過對無活性的人源尿酸氧化酶基因進(jìn)行多序列比對分析，針對15個高保守位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得與人源尿酸氧化酶氨基酸理論序列一致性達(dá)95.06%的“復(fù)活”尿酸氧化酶rhu15，但酶比活力僅為2.30u/mg，經(jīng)進(jìn)一步擴(kuò)大保守性位點(diǎn)的突變獲得19個位點(diǎn)的突變體rhu19（與人源尿酸氧化酶氨基酸理論序列一致性降為93.75%），酶比活力達(dá)到8.29u/mg。該文獻(xiàn)未對突變體進(jìn)行免疫原性的測試。另有文獻(xiàn)報(bào)道，即便與人源尿酸氧化酶氨基酸理論序列一致性高達(dá)93.75%的狒狒尿酸氧化酶，也可能導(dǎo)致顯著的免疫原性（文獻(xiàn)2：熊潤松.?狒狒尿酸氧化酶基因克隆及分子改造研究[d].?北京化工大學(xué),?2012.）。相比較于狒狒尿酸氧化酶，rhu19具有更低序列一致性，故可推測rhu19更類似于異源尿酸氧化酶而非人源，依然會存在顯著的免疫原性。由于通過所有高保守位點(diǎn)的回復(fù)突變復(fù)活人源尿酸酶假基因，存在著本質(zhì)上的非人源化，增加了復(fù)活酶的異源性，從而增加了免疫原性。

3、人源尿酸氧化酶作為一個在人的發(fā)育過程沒有以完整蛋白分子形式在體內(nèi)存在過的蛋白質(zhì)，對其復(fù)活策略存在雙重問題：一是通過不同物種來源同工酶氨基酸序列的保守性分析進(jìn)行突變恢復(fù)人源尿酸氧化酶的活性，在蛋白質(zhì)氨基酸序列上實(shí)際是進(jìn)行了非人源化，保守位點(diǎn)修復(fù)在恢復(fù)酶活性的同時卻增強(qiáng)了免疫原性；二是當(dāng)氨基酸序列人源化率達(dá)到一個閾值（例如95%）時，繼續(xù)提高人源化率反而導(dǎo)致酶活性顯著下降，甚至失去活性。

4、因此，目前通過同源比對并對保守性氨基酸突變進(jìn)行人源尿酸氧化酶假基因的功能復(fù)活策略面臨挑戰(zhàn)和困境，因此有必要尋找新的策略，以圖獲得具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的是提供一種具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體，該人源尿酸氧化酶突變體與人源尿酸氧化酶理論氨基酸序列保持較高同源性，在降低免疫原性的同時具有較高的酶活性。

2、本發(fā)明所述的具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體是由氨基酸序列為seq?id?no.1的無活性人源尿酸氧化酶經(jīng)突變獲得的人源尿酸氧化酶突變體；其具有第83位、第84位、第119位、第121位、第151位、第208位、第219位、第222位、第232位、第233位、第240位和第252位氨基酸取代。

3、根據(jù)本發(fā)明所述的具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體的進(jìn)一步特征，所述第83位氨基酸取代是用甘氨酸（g）取代谷氨酸（e）、第84位氨基酸取代是用半胱氨酸（c）或組氨酸（h）或天冬酰胺（n）或精氨酸（r）取代異亮氨酸（i）、第119位氨基酸取代是用精氨酸（r）取代組氨酸（h）、第121位氨基酸取代是用谷氨酸（e）取代甘氨酸（g）、第151位氨基酸取代是用脯氨酸（p）取代谷氨酰胺（q）、第208位氨基酸取代是用谷氨酸（e）取代賴氨酸（k）、第219位氨基酸取代是用亮氨酸（l）取代甲硫氨酸（m）、第222位氨基酸取代是用苯丙氨酸（f）取代絲氨酸（s）、第232位氨基酸取代是用絲氨酸（s）取代亮氨酸（l）、第233位氨基酸取代是用脯氨酸（p）取代蘇氨酸（t）、第240位氨基酸取代是用酪氨酸（y）取代半胱氨酸（c），第252位氨基酸取代是用谷氨酸（e）取代丙氨酸（a）；所述的定點(diǎn)突變改造的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列分別為?seq?id?no.?2、seq?id?no.?3、seq?id?no.?4和seq?idno.?5。

4、當(dāng)?shù)?4位氨基酸取代是用半胱氨酸（c）取代異亮氨酸（i）時，所述的定點(diǎn)突變改造的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為?seq?id?no.?2。

5、當(dāng)?shù)?4位氨基酸取代是用組氨酸（h）取代異亮氨酸（i）時，所述的定點(diǎn)突變改造的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為?seq?id?no.?3。

6、當(dāng)?shù)?4位氨基酸取代是用天冬酰胺（n）取代異亮氨酸（i）時，所述的定點(diǎn)突變改造的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.?4。

7、當(dāng)?shù)?4位氨基酸取代是用精氨酸（r）取代異亮氨酸（i）時，所述的定點(diǎn)突變改造的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列seq?id?no.?5。

8、本發(fā)明的第二個目的是提供了一種dna分子，其編碼本發(fā)明所述的免疫原性弱化且具有高活性的人源尿酸氧化酶突變體。

9、當(dāng)本發(fā)明所述的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.?2時，該人源尿酸氧化酶突變體的核苷酸序列為seq?id?no.?6。

10、當(dāng)本發(fā)明所述的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.?3時，該人源尿酸氧化酶突變體的核苷酸序列為seq?id?no.?7。

11、當(dāng)本發(fā)明所述的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.?4時，該人源尿酸氧化酶突變體的核苷酸序列為seq?id?no.?8。

12、當(dāng)本發(fā)明所述的人源尿酸氧化酶突變體的氨基酸序列為seq?id?no.?5時，該人源尿酸氧化酶突變體的核苷酸序列為seq?id?no.?9。

13、本發(fā)明的第三個目的是提供一種載體，其含有本發(fā)明所述的dna分子。

14、本發(fā)明的第四個目的是提供一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的dna分子，或者含有本發(fā)明所述的載體。

15、上述載體和宿主細(xì)胞都可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)手段進(jìn)行制備。

16、本發(fā)明的第五個目的是提供一種具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體的生產(chǎn)方法。

17、本發(fā)明所述的具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體的生產(chǎn)方法包括：在適于尿酸氧化酶突變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分離所述的具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體。

18、當(dāng)本發(fā)明所述的dna分子以合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體，或者轉(zhuǎn)入所述的宿主細(xì)胞中，所述的dna分子可以在任何真核或者原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。許多宿主-載體系統(tǒng)都可以用來表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于：用噬菌體、質(zhì)粒或粘粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；含有酵母載體的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用細(xì)菌感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選的載體包括病毒載體、質(zhì)粒、粘粒或者寡核苷酸。

19、本發(fā)明優(yōu)選的宿主為原核系統(tǒng)如大腸桿菌；本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)表達(dá)方法為桿菌的表達(dá)。

20、本發(fā)明的第六個目的是提供所述的具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突變體用于制備用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的藥物的應(yīng)用。

21、本發(fā)明是對人源尿酸氧化酶假基因（稱為huox基因）的無活性人源尿酸氧化酶的氨基酸序列進(jìn)行定點(diǎn)突變。人源尿酸氧化酶假基因序列的genbank登錄號為nr_003927.2。將序列中3位和187位的終止子改為r，成為無活性人源尿酸氧化酶的氨基酸序列（seq?idno.1）。

22、發(fā)明人在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上通過定點(diǎn)突變得到了經(jīng)過免疫弱化設(shè)計(jì)后仍能保持良好活性且人源化程度較高的尿酸氧化酶突變體rhuoxmut2?/i84c（seq?id?no.?2）、rhuoxmut2/i84h（seq?id?no.?3）、rhuoxmut2/i84n（seq?id?no.?4）和rhuoxmut2?/i84r（seq?id?no.5）。它們與人源尿酸氧化酶氨基酸理論序列的同源性為95.39%，比現(xiàn)有公開報(bào)道的尿酸氧化酶具有更高的人源化率，而它們的酶比活力分別為7.472u/mg、7.591u/mg、7.388u/mg、7.615u/mg，在突破文獻(xiàn)報(bào)道的同源性95%閾值的同時顯示出較高的酶活性。實(shí)驗(yàn)表明，它們具有較低的免疫原性，與人血清白蛋白（hsa）的免疫原性相近，原因是其蛋白表面抗原肽的熱點(diǎn)氨基酸進(jìn)一步被突變從而無法被識別，從而降低免疫原性。因此，本發(fā)明所述的具有免疫原性弱化且高活性的人源尿酸氧化酶突變體更符合低免疫原性尿酸氧化酶的臨床需求，適合在臨床治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的長期使用中的應(yīng)用，可用于制備用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的藥物。