本發明涉及基因檢測。具體地說是檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的引物對和探針、方法及試劑盒。

背景技術：

1、血流感染(bloodstream?infection，bsi)是一種嚴重危及生命的全身感染性疾病，尤其是由多重耐藥細菌(如耐碳青霉烯類的革蘭氏陰性桿菌)引起的血流感染，死亡率很高。鮑曼不動桿菌(acinetobacter?baumannii，ab)屬于非發酵條件致病革蘭陰性桿菌，是引發醫院內感染的常見病原菌之一。治療血流感染的關鍵就是病原菌的及時準確診斷和抗生素的有效使用，而鮑曼不動桿菌因其廣泛的耐藥性給血流感染的治療帶來了重重困難，嚴重危害病人的生命。

2、碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南等藥物，是血流感染經驗性治療的一線藥物之一，被視為鮑曼不動桿菌感染后治療的最后一道防線，其耐藥性的產生是造成血流感染鮑曼不動桿菌后死亡的最主要原因。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的最主要的機制是碳青霉烯酶，包括b類金屬β-內酰胺酶和d類苯唑西林酶(oxacillinase,oxa)，其中oxa-23是鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥最常見的基因之一。

3、目前，診斷血流感染的金標準仍然是血培養(blood?cultures,bc)陽性，相關統計指出臨床病人靜脈血培養至儀器可以檢測出的水平需要6小時至5天左右的時間，儀器報告血培養陽性之后需要一天的時間去將血培養陽性的血液在平板上面培養出一定量的單個菌落進行鑒定，鑒定后至少還需要一天去進行藥敏鑒定。所以從收集到標本到最終發藥敏報告至少耗時3天左右。有數據表明在記錄的低血壓前6小時內的膿毒癥患者中，適當的抗生素治療每延遲1小時會導致死亡率平均增加7.6％，及時準確地鑒定出病原體并選擇合適的抗菌藥物對血流感染早期患者的治療和預后至關重要。因此，研發快速診斷血流感染的新技術迫在眉睫。

4、目前研究的診斷血流感染較多的技術有宏基因組二代測序(mngs)、微滴數字pcr(ddpcr)和熒光定量pcr技術等，前兩者成本較高，故本技術建立了一種雙重qpcr反應體系來檢測血流感染中的鮑曼不動桿菌及其碳青霉烯類藥物的耐藥性，提高qpcr在檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌dna的靈敏度和特異性。

技術實現思路

1、為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的引物對和探針、方法及試劑盒，根據16srna和oxa-23基因設計并優化對應的引物和探針，通過16srna/oxa-23雙重qpcr擴增反應體系的構建，可快速和準確地檢測出血流感染中的鮑曼不動桿菌并判斷其是否存在碳青霉烯類耐藥，以此幫助臨床及時診斷、精準治療。

2、為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

3、檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的引物對和探針，其特征在于，包括特異性基因16srna的特異性引物對和與所述特異性引物對適配的特異性探針以及耐藥基因oxa-23的耐藥引物對和與所述耐藥引物對適配的耐藥探針；

4、所述特異性引物對的上游引物序列如seq?id?no：1所示，為5’-aag?cga?gga?ggaggc?tac?ttt?ag-3’；

5、所述特異性引物對的引物的下游引物序列如seq?id?no：2所示，為5’-cgg?ctgctg?gca?cag?agt-3’；

6、所述特異性探針序列如seq?id?no：3所示，為5-acg?tta?ctc?gca?gaa?taa?gcaccg?gct-3；

7、所述耐藥引物對的上游引物序列如seq?id?no：4所示，為5’-gac?act?agg?agaagc?cat?gaa?gct-3’；

8、所述耐藥引物對的下游引物序列如seq?id?no：5所示，為5’-gca?tga?gat?caagac?cga?tac?g-3’；

9、所述耐藥探針序列如seq?id?no：6所示，為5-tcc?cag?tct?atc?agg?aac?ttg?cgcg-3。

10、更進一步地，所述特異性引物對的濃度為300-600nm，所述耐藥引物對的濃度為300-600nm，所述特異性引物對和耐藥引物對的濃度比為500-600nm：300-500nm。

11、一種檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的試劑盒，包括特異性基因16srna的特異性引物對和和特異性探針組合以及耐藥基因oxa-23的耐藥引物對和耐藥探針組合：

12、所述特異性引物對的上游引物序列如seq?id?no：1所示，所述特異性引物對的引物的下游引物序列如seq?id?no：2所示，所述特異性探針序列如seq?id?no：3所示；

13、所述耐藥引物對的上游引物序列如seq?id?no：4所示，所述耐藥引物對的下游引物序列如seq?id?no：5所示，所述耐藥探針序列如seq?id?no：6所示。

14、更進一步地，所述試劑盒在含有耐藥基因oxa-23的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌引起的疾病的藥物制備中的應用。

15、更進一步地，所述試劑盒用于qpcr擴增反應體系，其中20μl的反應體系包括：

16、cr?mix?10μl、10μm的引物對和探針；

17、引物對，特異性引物對的上游引物和下游引物各1μl及耐藥引物對的上游引物和下游引物各1μl、探針包括特異性探針0.5μl及耐藥探針0.5μl；

18、dna的模板2μl；

19、蒸餾水補足20μl。

20、一種檢測碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的方法，包括特異性基因16srna的特異性引物對和與所述特異性引物對適配的特異性探針以及耐藥基因oxa-23的耐藥引物對和與所述耐藥引物對適配的耐藥探針；

21、所述特異性引物對的上游引物序列如seq?id?no：1所示，所述特異性引物對的引物的下游引物序列如seq?id?no：2所示，所述特異性探針序列如seq?id?no：3所示；

22、所述耐藥引物對的上游引物序列如seq?id?no：4所示，所述耐藥引物對的下游引物序列如seq?id?no：5所示，所述耐藥探針序列如seq?id?no：6所示；

23、包括如下步驟：

24、s1、從待測樣品中提取dna；

25、s2、以提取的dna為模板構建總體積為20μl的雙重qpcr反應體系，加入濃度為10μm的特異性引物對和特異性探針以及耐藥引物對和耐藥探針進行qpcr擴增反應；

26、s3、驗證雙重qpcr反應體系中16srna和oxa-23的檢測限以及線性關系。

27、更進一步地，步驟s2中，qpcr擴增步驟為：按照95℃預變性30秒-95℃變性5秒-60℃退火30秒的順序進行39個循環。

28、更進一步地，所述的雙重qpcr反應體系的退火溫度為57.3℃-58.4℃。

29、本發明的技術方案取得了如下有益的技術效果

30、在同一反應體系中加入16srna和oxa-23兩個基因的對應引物，能有效將鮑曼不動桿菌和其他26種病原菌區分開，檢測鮑曼不動桿菌的同時可以判斷其碳青霉烯類耐藥性，同時擴增兩個基因片段，體現雙重qpcr高效、低成本的優勢，同時具有高靈敏度、強特異性和寬檢測范圍，還可以快速、準確地檢測血流感染中的crab。