本發(fā)明屬于食品檢測，尤其涉及一種檢測牛肉的rpa-pfago檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、牛肉因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值、獨(dú)特的口感，在全球肉類消費(fèi)市場中占據(jù)重要地位，深受消費(fèi)者喜愛。然而，隨著市場需求的不斷增長，牛肉市場也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，其中肉類摻假問題尤為突出。一些不法商家為追求高額利潤，常常將價(jià)格相對低廉的肉類，如豬肉、雞肉、鴨肉等，摻入高價(jià)的牛肉中以次充好。這種欺詐行為不僅嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的切身利益，破壞了市場的公平競爭環(huán)境，還可能引發(fā)一系列食品安全問題，對公眾健康構(gòu)成潛在威脅。因此，準(zhǔn)確識別肉類物種對于保護(hù)消費(fèi)者利益、遵守法律標(biāo)準(zhǔn)以及防止食品行業(yè)的欺詐行為至關(guān)重要。

2、近年來，肉類識別的進(jìn)展已從形態(tài)學(xué)和基于蛋白質(zhì)的檢測方法發(fā)展到復(fù)雜的核酸檢測方法?，F(xiàn)有技術(shù)中通常依賴于pcr，以及dna條形碼、微滴式數(shù)字pcr(ddpcr)、電子鼻和電子舌技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)和光譜分析等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)牛肉的檢測。然而dna條形碼對檢測近親種類的摻假效果較差；ddpcr其高設(shè)備和操作要求限制了快速部署；電子鼻技術(shù)成本高且對環(huán)境敏感的特性，限制了其廣泛使用；elisa具有高靈敏性和特異性，但特定抗體的可用性有限，基質(zhì)效應(yīng)可能干擾結(jié)果；光譜方法雖然詳細(xì)，但耗時(shí)且成本高，且對設(shè)備規(guī)格要求嚴(yán)格，使其不適合大規(guī)?？焖佻F(xiàn)場檢測。重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，雖然靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，然而也正是由于其靈敏度過高，在實(shí)際操作中極易受到環(huán)境中核酸污染的影響，導(dǎo)致假陽性結(jié)果頻繁出現(xiàn)。而且，在現(xiàn)場環(huán)境中執(zhí)行單管多重檢測時(shí)，這兩種技術(shù)面臨諸多困難，難以有效區(qū)分目標(biāo)核酸和污染核酸，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，開發(fā)一種高效、準(zhǔn)確、可靠的牛肉檢測技術(shù)，迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測牛肉的rpa-pfago檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用，本發(fā)明通過將rpa技術(shù)與來自極端嗜熱古菌的argonaute蛋白進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對牛肉的準(zhǔn)確識別，為快速現(xiàn)場檢測提供了實(shí)用解決方案，增強(qiáng)了商業(yè)和監(jiān)管環(huán)境中對牛肉的驗(yàn)證。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種檢測牛肉的rpa-pfago檢測系統(tǒng)，所述rpa-pfago檢測系統(tǒng)包括針對牛肉基因所設(shè)計(jì)的rpa特異性引物對、pfago蛋白的gdna1-1與gdna1-2序列以及探針；

4、所述rpa特異性引物對為seq?id?no.2與seq?id?no.4、seq?id?no.2與seq?idno.6或seq?id?no.3與seq?id?no.4；

5、所述gdna1-1序列如seq?id?no.7所示；

6、所述gdna1-2序列如seq?id?no.8所示；

7、所述探針的序列如seq?id?no.11所示。

8、作為優(yōu)選，所述探針標(biāo)記熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam或rox。

9、本發(fā)明提供了所述的rpa-pfago檢測系統(tǒng)在檢測牛肉中的應(yīng)用，所述檢測為出現(xiàn)熒光表明所檢測的肉類含有牛肉。

10、本發(fā)明還提供了一種檢測牛肉的試劑盒，包括所述的rpa-pfago檢測系統(tǒng)、緩沖液、醋酸鎂、pfago酶、mncl2、buffer、水。

11、作為優(yōu)選，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟：

12、(1)提取樣品dna；

13、(2)利用rpa特異性引物對對提取的樣品dna進(jìn)行擴(kuò)增，獲得rpa產(chǎn)物；

14、(3)將步驟(2)獲得的rpa產(chǎn)物、gdna1-1序列、gdna1-2序列、探針、pfago酶、mncl2、buffer和水混合，進(jìn)行pfago酶切反應(yīng)，出現(xiàn)熒光，表明樣品中含有牛肉。

15、作為優(yōu)選，步驟(2)所述擴(kuò)增體系以50μl計(jì)，包括29.5μl緩沖液、初始濃度為10μm的所述的rpa特異性引物對的上下游引物各2μl、2μl樣品dna、2～5μl初始濃度為280mm的醋酸鎂、水補(bǔ)足至50μl。

16、作為優(yōu)選，所述擴(kuò)增的溫度為30～45℃，所述擴(kuò)增的時(shí)間為10～40min。

17、作為優(yōu)選，步驟(3)所述pfago酶切反應(yīng)體系以25μl計(jì)，所述rpa產(chǎn)物的使用量為1～10μl；所述gdna1-1的濃度為1～100μm；所述gdna1-2的濃度為1～100μm；所述探針的濃度為1～100μm；所述mncl2的使用量為1～6μl；pfago酶的使用量為1～6μl。

18、作為優(yōu)選，所述pfago酶切反應(yīng)的溫度為90～100℃，所述pfago酶切反應(yīng)的時(shí)間為25～35min。

19、作為優(yōu)選，所述熒光的激發(fā)波長為470nm或525nm。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供了一種檢測牛肉的rpa-pfago檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用，本發(fā)明利用rpa的高效性和特異性，結(jié)合來自極端嗜熱古菌(pyrococcus?furiosus)的argonaute蛋白(pfago)以增強(qiáng)檢測能力。本發(fā)明通過對rpa-pfago檢測系統(tǒng)的優(yōu)化，增強(qiáng)了對牛肉識別的特異性和靈敏性。并通過分析超市的商業(yè)肉類產(chǎn)品和人工摻假的肉類樣品，測試了該系統(tǒng)的普適適用性。為快速現(xiàn)場檢測提供了實(shí)用解決方案，增強(qiáng)了商業(yè)和監(jiān)管環(huán)境中對牛肉準(zhǔn)確識別的驗(yàn)證。

技術(shù)特征：

1.一種檢測牛肉的rpa-pfago檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述rpa-pfago檢測系統(tǒng)包括針對牛肉基因所設(shè)計(jì)的rpa特異性引物對、pfago蛋白的gdna1-1與gdna1-2序列以及探針；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rpa-pfago檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述探針標(biāo)記熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam或rox。

3.權(quán)利要求1或2所述的rpa-pfago檢測系統(tǒng)在檢測牛肉中的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測為出現(xiàn)熒光表明所檢測的肉類含有牛肉。

4.一種檢測牛肉的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的rpa-pfago檢測系統(tǒng)、緩沖液、醋酸鎂、pfago酶、mncl2、buffer、水。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)所述擴(kuò)增體系以50μl計(jì)，包括29.5μl緩沖液、初始濃度為10μm的權(quán)利要求1所述的rpa特異性引物對的上下游引物各2μl、2μl樣品dna、2～5μl初始濃度為280mm的醋酸鎂、水補(bǔ)足至50μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增的溫度為30～45℃，所述擴(kuò)增的時(shí)間為10～40min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(3)所述pfago酶切反應(yīng)體系以25μl計(jì)，所述rpa產(chǎn)物的使用量為1～10μl；所述gdna1-1的濃度為1～100μm；所述gdna1-2的濃度為1～100μm；所述探針的濃度為1～100μm；所述mncl2的使用量為1～6μl；pfago酶的使用量為1～6μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述pfago酶切反應(yīng)的溫度為90～100℃，所述pfago酶切反應(yīng)的時(shí)間為25～35min。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光的激發(fā)波長為470nm或525nm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種檢測牛肉的RPA?PfAgo檢測系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述RPA?PfAgo檢測系統(tǒng)包括針對牛肉基因所設(shè)計(jì)的RPA特異性引物對、PfAgo蛋白的gDNA1?1與gDNA1?2序列以及探針。本發(fā)明利用RPA的高效性和特異性，結(jié)合來自極端嗜熱古菌的Argonaute蛋白增強(qiáng)了檢測能力。并通過對RPA?PfAgo檢測系統(tǒng)的優(yōu)化，增強(qiáng)了對牛肉識別的特異性和靈敏性。通過對超市中的肉類產(chǎn)品和人工摻假的肉類樣品的檢測，測試了該系統(tǒng)的普適適用性。為快速現(xiàn)場檢測提供了實(shí)用解決方案，增強(qiáng)了商業(yè)和監(jiān)管環(huán)境中對牛肉準(zhǔn)確識別的驗(yàn)證。

技術(shù)研發(fā)人員：劉亞群,鄭玉忠,張振霞,陳良輝,黃瓊露,張慷,葉秋萍,劉鑫
受保護(hù)的技術(shù)使用者：韓山師范學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28