本發(fā)明屬于分子生物學，具體涉及一種與紫花苜蓿木質(zhì)素含量相關(guān)的分子標記lig1及其應用。

背景技術(shù)：

1、紫花苜蓿是世界上栽培面積最大的豆科牧草，粗蛋白含量高，營養(yǎng)價值豐富，被譽為“牧草之王”。木質(zhì)素含量對紫花苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響。木質(zhì)素是植物細胞壁的重要組成部分，與纖維素緊密結(jié)合。它難以被牲畜消化，且會阻礙纖維素和半纖維素的降解，從而降低紫花苜蓿的消化率。木質(zhì)素含量越高，牲畜對苜蓿的消化難度越大，營養(yǎng)吸收效率越低。例如，研究表明，當紫花苜蓿的木質(zhì)素含量從10%增加到15%時，其相對飼料價值（rfv）會顯著降低，牲畜的干物質(zhì)采食量（dmi）也會減少。

2、選育低木質(zhì)素紫花苜蓿新品種是提高紫花苜蓿品質(zhì)的主要措施之一。傳統(tǒng)低木質(zhì)素紫花苜蓿新品種選育是根據(jù)育種后代木質(zhì)素含量進行的單株選擇，這種方法耗時耗力，且準確性不高。利用目標基因存在的堿基差異，開發(fā)特異性分子標記進行輔助選擇是提高選擇效率的最佳方法。競爭性等位基因特異性pcr?(kompetitive?allele-specific?pcr，kasp)分子標記是建立在等位基因特異性擴增(amplification?refractory?mutationsystem，arms)和高靈敏度的熒光檢測基礎(chǔ)之上的一種新型snp分型方法。其原理是針對等位基因snp位點設(shè)計兩個正向引物和一個通用反向引物，每條正向引物都有特異性序列，可與不同熒光標記結(jié)合。帶有與不同熒光結(jié)合序列的正向引物與通用反向引物pcr擴增待測樣品的dna，其等位變異就可以通過不同的熒光信號得以反映(he?c?l?,et?al?.snpgenotyping:the?kasp?assay?.methodsmolbiol,2014,1145:75-86)。

3、因此，開發(fā)與紫花苜蓿木質(zhì)素含量緊密連鎖的kasp標記，用于育種早期選擇，對減少育種工作量、加速紫花苜蓿品質(zhì)育種至關(guān)重要，同時經(jīng)濟效益明顯。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為快速培育出不同木質(zhì)素含量的紫花苜蓿材料提供一種新選擇。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是一種與紫花苜蓿木質(zhì)素含量相關(guān)的分子標記lig1，具體信息如下：染色體：chr1；位置：16779657；snp分型：g/a。

3、更進一步的，所述分子標記lig1的核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示。

4、本發(fā)明還提供了擴增所述分子標記lig1的引物組合，其核苷酸序列如seq?idno.3~5所示。

5、本發(fā)明還提供了一種分子標記檢測試劑盒，包括seq?id?no.3~5所示的引物。

6、本發(fā)明還提供了一種分子標記芯片，包括seq?id?no.3~5所示的引物。

7、本發(fā)明還提供了所述分子標記lig1、擴增所述分子標記lig1的引物組合、所述試劑盒和/或所述分子標記芯片在任選一項中的應用：

8、a、預測紫花苜蓿木質(zhì)素含量；

9、b、鑒定及篩選不同木質(zhì)素含量的紫花苜蓿；

10、c、選育具有低木質(zhì)素含量的紫花苜蓿；

11、d、紫花苜蓿分子標記輔助育種；

12、e、紫花苜蓿育種；

13、f、制備紫花苜蓿育種的產(chǎn)品。

14、本發(fā)明還提供了一種篩選不同木質(zhì)素含量紫花苜蓿材料的方法，包括如下步驟：提取待測紫花苜蓿材料的基因組dna，采用seq?id?no.3~5所述引物擴增分子標記lig1，對擴增產(chǎn)物進行測序，分型篩選。

15、具體的，所述擴增程序如下：94℃?15min；95℃?20sec，65~56℃?60sec，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火延伸溫度降低0.8℃；94℃?20sec，57℃?60sec，30個循環(huán)。

16、特別的，所述分型篩選的標準如下：若分型結(jié)果為aa，為低木質(zhì)素材料；若分型結(jié)果為ga或gg為高木質(zhì)素材料。

17、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明篩選到一個與紫花苜蓿木質(zhì)素含量相關(guān)的kasp標記lig1；并開發(fā)了針對該標記的引物組合。所述引物組合能直接對snp突變位點的a或g堿基進行特異區(qū)分和檢測，可簡便、精確地實現(xiàn)對低木質(zhì)素紫花苜蓿種質(zhì)材料的快速篩選，對紫花苜蓿品質(zhì)育種具有重要意義。本發(fā)明的分子標記具有良好的應用價值，可實現(xiàn)對紫花苜蓿木質(zhì)素含量性狀的預先選擇和分子輔助育種，對于加快木質(zhì)素含量育種的遺傳改良進程，提高選擇效率具有重要的理論和實踐意義。

技術(shù)特征：

1.一種與紫花苜蓿木質(zhì)素含量相關(guān)的分子標記lig1，其特征在于：具體信息如下：染色體：chr1；位置：16779657；snp分型：g/a。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標記lig1，其特征在于：所述分子標記lig1的核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示。

3.擴增權(quán)利要求1或2所述分子標記lig1的引物組合，其特征在于：其核苷酸序列如seqid?no.3~5所示。

4.一種分子標記檢測試劑盒，其特征在于：包括seq?id?no.3~5所示的引物。

5.一種分子標記芯片，其特征在于：包括seq?id?no.3~5所示的引物。

6.權(quán)利要求1或2所述分子標記lig1、權(quán)利要求3所述分子標記lig1的引物組合、權(quán)利要求4所述試劑盒和/或權(quán)利要求5所述分子標記芯片在任選一項中的應用：

7.一種篩選不同木質(zhì)素含量紫花苜蓿材料的方法，其特征在于：包括如下步驟：提取待測紫花苜蓿材料的基因組dna，采用seq?id?no.3~5所述引物擴增分子標記lig1，對擴增產(chǎn)物進行測序，分型篩選。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于：所述擴增程序如下：94℃?15min；95℃20sec，65~56℃?60sec，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火延伸溫度降低0.8℃；94℃?20sec，57℃60sec，30個循環(huán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于：所述分型篩選的標準如下：若分型結(jié)果為aa，為低木質(zhì)素材料；若分型結(jié)果為ga或gg為高木質(zhì)素材料。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明的目的是為快速培育出不同木質(zhì)素含量的紫花苜蓿材料提供一種新選擇。本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與紫花苜蓿木質(zhì)素含量相關(guān)的分子標記Lig1及其應用。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種與紫花苜蓿木質(zhì)素含量緊密連鎖的分子標記Lig1，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1或SEQ?ID?No.2所示；SNP分型：G/A。本發(fā)明開發(fā)的KASP引物組合能直接對SNP突變位點的A或G堿基進行特異區(qū)分和檢測，可簡便、精確地實現(xiàn)對低木質(zhì)素紫花苜蓿種質(zhì)材料的快速篩選，對紫花苜蓿品質(zhì)育種具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：陳林,劉昊,張雨琪,何飛,龍瑞才,康俊梅,楊青川
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28