本發(fā)明屬于生物制藥和生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶突變體、編碼基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脂肪酶具有良好的水解、轉(zhuǎn)酯、酯化、酯交換等反應(yīng)的催化能力，在食品、化工、醫(yī)藥、生物能源等行業(yè)中應(yīng)用廣泛。微生物中來源的脂肪酶已然成為工業(yè)應(yīng)用中脂肪酶的主要來源。南極假絲酵母脂肪酶b(calb)是來源于南極假絲酵母(candida?antarctica)，calb由于具有出色的酯合成、水解、轉(zhuǎn)酯等催化活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。

2、(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸作為手性化合物是一種重要的化學(xué)試劑或醫(yī)藥中間體，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域。(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸可以用于生成(s)-3,4-二氨基環(huán)己烷羧酸，這是凝血因子xa(fxa)抑制劑依度沙班(edoxaban，商品名：savaysa)的關(guān)鍵手性砌塊。該藥物用于治療癌癥相關(guān)的靜脈血栓栓塞癥，與同類型凝血因子xa抑制劑藥物如利伐沙班和阿哌沙班相比，具有腎臟負(fù)擔(dān)小、出血風(fēng)險(xiǎn)小、安全可靠等突出優(yōu)點(diǎn)，市場前景廣闊。而(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸作為該藥物的關(guān)鍵中間體，其高效制備技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。

3、目前手性3-環(huán)己烯-1-甲酸的合成方法主要有以下三種：狄爾斯-阿爾德(diels-alder)反應(yīng)、化學(xué)法外消旋酸拆分法和酶法不對稱水解拆分3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯。其中diels-alder反應(yīng)是目前合成手性3-環(huán)己烯-1-甲酸的主要方法，然而其反應(yīng)中丁二烯為氣體且產(chǎn)物不易于分離，反應(yīng)步驟多，最終收率較低，該方法仍需進(jìn)一步提升。化學(xué)法外消旋酸拆分法的分離需通過至少六次在丙酮中的重結(jié)晶過程，這一化學(xué)拆分方法不僅耗費(fèi)大量丙酮，而且拆分后的收率僅介于20-30％，經(jīng)濟(jì)性能較低。由此可見，采用化學(xué)法合成手性3-環(huán)己烯-1-甲酸具有操作步驟多、收率低和大量丙酮的消耗等問題。采用生物酶催化拆分手性化合物具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、污染低及操作簡捷等優(yōu)點(diǎn)，這使其在推動(dòng)可持續(xù)發(fā)展的進(jìn)程中，成為替代或補(bǔ)充傳統(tǒng)化學(xué)合成途徑的一種重要途徑。

4、在2004年，cihangir?t等人研究了三種酶：豬肝酯酶(ple)、馬肝酯酶(hle)和豬胰脂肪酶(ppl)，具有對于外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的水解功能。結(jié)果顯示，ple和hle的水解產(chǎn)物均為(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸，且ee值分別超過99％和達(dá)到97％；而ppl的水解產(chǎn)物為(r)-3-環(huán)己烯-1-甲酸，其ee值為91％。然而，這三種酶均來自動(dòng)物，作為商品酶在實(shí)際應(yīng)用中面臨多重挑戰(zhàn)，包括：高昂的成本、同工酶的干擾、批次間存在顯著的差異性以及潛在的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。

5、2019年，竇哲等人采用3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯作為底物，開展對野生菌株進(jìn)行篩選的工作，并成功發(fā)現(xiàn)一株名為acinetobacter?sp.jnu9335的菌株，該菌株能夠選擇性地催化水解底物，剩下的(s)-3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，通過堿性條件下的進(jìn)一步水解，得到了目標(biāo)產(chǎn)物(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸。在50ml反應(yīng)中加入3.50g外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，反應(yīng)12h，最終得到收率為40％的目標(biāo)產(chǎn)物，e.e.值高達(dá)99％。2020年竇哲等人成功獲取了環(huán)己烯甲酸酯水解酶acest1及其突變體，利用活力增強(qiáng)的突變體f78v/a202k/g326a的粗酶粉，能夠催化58.7g外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，剩余(s)-3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，通過堿水解處理，獲得了22.3g(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸，收率達(dá)到38％，且產(chǎn)物的氣相色譜(gc)純度為99％，光學(xué)純度高達(dá)99.5％e.e.。之后在2021年，竇哲等人又公開了一種新型羧酯酶carest3及其突變體，該酶具有出色的催化能力，能夠處理高達(dá)500g/l外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，最終得到的(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸總收率為37％，光學(xué)純度為99％e.e.。

6、與傳統(tǒng)化學(xué)合成法相比，利用生物酶催化制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸的方法具有反應(yīng)條件溫和、對映體選擇性高、環(huán)境友好和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但目前關(guān)于(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸制備方法僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，同時(shí)存在酶選擇性較低致使產(chǎn)品收率低等缺陷，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，并且缺乏關(guān)于脂肪酶calb催化合成(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸的報(bào)道。因此，需要篩選具有高催化效率的對映選擇性互補(bǔ)的脂肪酶calb的突變體，用于滿足工業(yè)化生產(chǎn)(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的利用生物酶催化制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸工藝存在酶選擇性較低致使產(chǎn)品收率低、催化效率低、難以適用于工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷，提供了一種脂肪酶突變體、突變體編碼基因、含有該突變體編碼基因的重組載體、含有該突變體編碼基因的重組基因工程菌，并將脂肪酶突變體應(yīng)用于制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸的工業(yè)化生產(chǎn)工藝中。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種脂肪酶calb突變體，由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而來，所述突變的位點(diǎn)為下列中的一個(gè)或多個(gè)：(1)第40位、(2)第134位、(3)第154位、(4)第189位、(5)第278位、(6)第281位。

4、作為優(yōu)選，所述脂肪酶calb突變體由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而來，所述突變的位點(diǎn)為下列中的一個(gè)或兩個(gè)：(2)第134位、(6)第281位。

5、作為優(yōu)選，所述突變體由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)下列之一或多個(gè)位點(diǎn)突變而得：(1)第40位蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?2)第134位天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸，(3)第154位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?4)第189位異亮氨酸突變?yōu)榫彼幔?5)第278位賴氨酸突變?yōu)樘於彼幔?6)第281位丙氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

6、一種核酸分子，所述核酸分子含有如上所述的脂肪酶calb突變體的編碼序列。

7、一種重組載體，所述重組載體含有如上所述的編碼序列。

8、一種重組基因工程菌，所述重組基因工程菌含有如上所述的重組載體。

9、作為優(yōu)選，所述重組基因工程菌以大腸桿菌為表達(dá)宿主。

10、本發(fā)明提供一種重組脂肪酶calb突變體的編碼基因，含編碼基因的重組載體以及重組載體構(gòu)建的重組基因工程菌，表達(dá)載體為pet28b(+)，重組基因工程菌宿主為e.colibl21(de3)。

11、本發(fā)明的重組脂肪酶calb突變體是通過對野生型脂肪酶calb進(jìn)行多個(gè)特定氨基酸位點(diǎn)的突變，目的是增強(qiáng)其對外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的對映體拆分能力。首先，將野生型南極假絲酵母脂肪酶b的編碼基因(其序列如seq?id?no.2所示)與表達(dá)載體pet28b(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。然后將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli?bl21(de3)中。將含有脂肪酶calb編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒做為模板，通過定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行基因改造，然后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli?bl21(de3)中，得到含有重組脂肪酶calb突變體的編碼基因的重組基因工程菌。將獲得的重組基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵液通過離心得到含有重組脂肪酶calb突變體的濕菌體細(xì)胞。將濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，在冰浴條件下，進(jìn)行超聲破碎，低溫離心收集上清，最終得到脂肪酶calb突變體粗酶液。將突變體脂肪酶calb與野生型脂肪酶calb的立體選擇性進(jìn)行比較，篩選具有拆分性能優(yōu)異的突變體。

12、如上所述的脂肪酶calb突變體在制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸中的應(yīng)用。

13、作為優(yōu)選，所述的應(yīng)用為：將磷酸鹽緩沖溶液、3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯、含脂肪酶calb突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)超聲破碎后提取的粗酶液混合均勻，進(jìn)行催化反應(yīng)，得到(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸。

14、相比較于傳統(tǒng)化學(xué)法制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸，本發(fā)明提供的脂肪酶calb突變體立體選擇性高，反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好，且對設(shè)備要求較低，大大減少了生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中顯示出廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的脂肪酶calb具有較高的催化活性，使得反應(yīng)條件溫和，底物轉(zhuǎn)化率高，對映體選擇性較高，生產(chǎn)成本降低且對環(huán)境友好。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)氨基酸的多個(gè)不同位點(diǎn)的突變，能夠提高脂肪酶calb對外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的催化活性和立體選擇性。本發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和、底物濃度高、立體選擇性高、催化劑處理步驟簡單、對壞境友好的優(yōu)點(diǎn)，例如10℃條件下，40g/l的脂肪酶calb突變體能夠在6h內(nèi)催化70g/l的外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，轉(zhuǎn)化率為52％，e.e.p值為72％。

15、作為優(yōu)選，催化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為0～40℃，反應(yīng)時(shí)間為2～12h。

16、作為進(jìn)一步優(yōu)選，催化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為10℃，反應(yīng)時(shí)間為6h。

17、作為優(yōu)選，磷酸鹽緩沖溶液中含有的磷酸鹽的濃度為50～200mm。

18、作為進(jìn)一步優(yōu)選，磷酸鹽緩沖溶液中含有的磷酸鹽的濃度為200mm。

19、作為優(yōu)選，磷酸鹽緩沖溶液包括磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉。

20、作為優(yōu)選，磷酸鹽緩沖溶液的ph值為6～9。

21、作為進(jìn)一步優(yōu)選，磷酸鹽緩沖溶液的ph值為7。

22、作為優(yōu)選，3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的濃度為20～140g/l。

23、作為進(jìn)一步優(yōu)選，3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的濃度為70g/l。

24、作為優(yōu)選，催化反應(yīng)中添加的含脂肪酶calb突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的濃度為10～100g/l。

25、作為進(jìn)一步優(yōu)選，催化反應(yīng)中添加的含脂肪酶calb突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的濃度為40g/l。

26、作為優(yōu)選，通過有機(jī)試劑萃取酶催化反應(yīng)液中的(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸的方法，包括以下步驟：

27、酶催化反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積的3m?hcl終止反應(yīng)，再加入兩倍體積的有機(jī)試劑乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并萃取后的有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥除去多余水分，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸。

28、作為優(yōu)選，所述濕菌體的制備方法包括以下步驟：

29、將含有重組脂肪酶calb突變體編碼基因的工程菌接種至含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基，在37℃、180rpm條件下培養(yǎng)10～12h，再以體積濃度2％接種量接種至含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm條件下培養(yǎng)至菌體od600為0.6～0.8，加入終濃度為1mm?iptg，在28℃、180rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4℃、8000rpm、離心10min，棄上清，收集沉淀，得到含有重組脂肪酶calb突變體編碼基因的重組基因工程菌的濕菌體。

30、作為優(yōu)選，粗酶液的制備方法包括以下步驟：

31、將含有重組脂肪酶calb突變體編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體按照每0.4g濕菌體加入9.6ml的200mm、ph為7.0的磷酸鈉鹽緩沖溶液重懸濕菌體；細(xì)胞重懸液在冰浴和60w功率條件下進(jìn)行超聲破碎，持續(xù)2s，間歇4s，連續(xù)破碎10min，獲得細(xì)胞破碎液；將超聲破碎后獲得的細(xì)胞破碎液在8000rpm、4℃條件下離心10min，所得到的上清即為粗酶液。

32、因此，本發(fā)明具有以下有益效果：

33、(1)本發(fā)明通過設(shè)計(jì)氨基酸的多個(gè)不同位點(diǎn)的突變，能夠提高脂肪酶calb對外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯的催化活性和立體選擇性；

34、(2)本發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和、底物濃度高、立體選擇性高、催化劑處理步驟簡單、對壞境友好的優(yōu)點(diǎn)，且對設(shè)備要求降低，大大減少了生產(chǎn)成本，在工業(yè)化應(yīng)用中顯示出廣泛的應(yīng)用前景；

35、(3)相比較于傳統(tǒng)化學(xué)法制備(s)-3-環(huán)己烯-1-甲酸，本發(fā)明提供的脂肪酶calb突變體立體選擇性高，轉(zhuǎn)化率高，10℃條件下，40g/l的脂肪酶calb突變體能夠在6h內(nèi)催化70g/l的外消旋3-環(huán)己烯-1-羧酸甲酯，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)52％，e.e.p值最高可達(dá)72％。