本發明涉及醫學檢測領域，具體涉及一種crispr/cas12a非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒及檢測方法。

背景技術：

1、肺炎支原體（mycoplasma?pneumoniae）是一種可引起人類呼吸道感染的非典型病原體，屬于支原體科（mycoplasmataceae）。它是導致支原體肺炎的主要病原體，也可引發支氣管炎、咽炎等上呼吸道感染。支原體感染后從普通的上呼吸道感染可發展成致死性肺炎等一系列的嚴重呼吸道疾病。肺炎支原體能在人工合成的培養基上自我繁殖的最小原核生物呈現“荷包蛋狀”菌落，其無細胞壁結構。支原體沒有成熟的細胞核，細胞結構十分簡單。基因組為環狀雙股螺旋，大小介于500~2200kb之間，其g+c含量偏低。支原體的p1蛋白基因具有高度的保守性，其大小約為5000bp，編碼黏附蛋白，分子量大約為170kd，具有多種抗原決定簇，是肺炎支原體黏附宿主的關鍵蛋白。其中p1蛋白的repmp區域的基因序列的差異可作為肺炎支原體分型的重要依據。

2、分離培養是檢測支原體的金標準，但因其培養條件嚴格且所需時間長，很難適應臨床應用的需要。目前對于mp的檢測依舊依賴于膠體金法血清學抗體檢測和pcr法核酸檢測等傳統的實驗室檢測手段。其中，基于抗原抗體反應的膠體金等免疫學方法檢測速度快、便攜、價格低廉，但干擾因素多、特異性和靈敏度低等問題限制了它的實際應用；此外，基于pcr方法的核酸檢測近年來逐漸進入臨床，盡管pcr法具有良好的靈敏度和特異性，但它依賴于昂貴的儀器設備、嚴格的實驗條件以及人員資質準入等要求，其應用場景通常僅限于中央實驗室，難以推廣至床旁即時檢測（poct）。

3、研究發現crispr/cas作為一種的分子檢測技術，具有操作簡單，檢測時間短，需要的儀器便攜，可實現即時檢測（poct）等優勢，可彌補現有技術的不足。crispr/cas在grna的引導下特異性識別靶向序列后，激活其非特異性的切割活性轉換檢測靶標信號為檢測信號。然而crispr/cas系統在無體外擴增的情況下，檢測靈敏度較低，因此首先需要對檢測的靶向序列進行體外擴增，提高檢測靈敏度。因此將crispr/cas12與體外核酸擴增技術結合，提高其檢測的靈敏度，但此過程容易引起交叉污染，同時需要額外的操作步驟，增加了檢測過程的復雜性。因此需要進一步優化基于crispr/cas非擴增技術的核酸檢測過程，以提高檢測靈敏度、保持檢測特異性并不斷縮減檢測時間。

4、綜上所述，如何有效解決crispr/cas非擴增靈敏度低下的問題，是其突破商業化應用的瓶頸，因此本發明旨在解決這一難題。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提供一種非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒及檢測方法，包括：

2、肺炎支原體p1片段的保守序列對應的crrna文庫；

3、crispr/cas12a反應體系，其包括buffer、cas12酶和單鏈雙光標記dna（ssdna）探針；

4、熒光檢測試紙。

5、作為優選的，所述crrna文庫是通過分析肺炎支原體核酸序列的保守性，采用crispr-era軟件設計獲得的crrna文庫序列。

6、一種crispr/cas12a肺炎支原體核酸的檢測方法，基于上述方案所述的crispr/cas12a非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

7、s01、從肺炎支原體樣本中提取出dna；

8、s02、對所述提取出dna利用pcr反應體系進行擴增，以獲得target1、target2和target3三個特定的目標dna片段；

9、s03、對所述步驟s02中pcr反應體系進行擴增后產物進行10倍梯度的稀釋，以得到不同濃度的target1、target2和target3的dna溶液；

10、s04、利用所述crispr/cas12a反應體系對獲取的不同濃度的target1、target2和target3的dna溶液進行單個crrna檢測活性的篩選，以篩選獲得有活性的crrna；

11、s05、獲得有活性的crrna，并針對每個target的crrna分別進行2個、4個、6個crrna的組合篩選，以確定每個target的最佳crrna組合體系；

12、s06、將已確定的各target的最佳crrna組合反應體系進一步組合，形成包含target1、target2和target3的多靶點組合，篩選以得到一個最佳的多靶點組合反應體系；

13、s07、在37℃的條件下，采用熒光檢測儀器每30s采集一次熒光信號，總采集180次，分析檢測實時熒光信號強度的變化過程，以優化獲得最佳crrna和target的反應體系；

14、s08、將所述最佳crrna和target的反應體系進行試紙條檢測，將試紙條放入反應管中反應5min后讀取信號。

15、作為優選的，所述步驟s01中所述提取樣本中的dna的提取方法為磁珠法。

16、作為優選的，所述步驟s03中不同濃度的dna溶液包括10000pm、1000pm、100pm、10pm、1pm、0.1pm、0.01pm。

17、作為優選的，所述步驟s04、所述步驟s05以及所述步驟s06中執行crispr/cas12a反應體系包括加入濃度為3μl的buffer、加入濃度25nm~30nm的cas12a酶、使用單鏈雙光標記dna（ssdna）探針的濃度300~450nm、target1、target2和target3的dna終濃度10000、1000、100、10、1、0.1、0.01pm，而每個crrna的濃度為300nm~450nm，最后補入無酶h2o?使得液體的總體積保持在30?μl。

18、本發明的技術效果和優點：通過構建優化crrna庫的方法建立非擴增的crispr/cas12a檢測肺炎支原體核酸，有效解決了肺炎支原體pcr檢測過程中對特殊儀器及專業人員依賴的關鍵限制問題，以及實現快速床旁檢測難的問題，縮短了檢測時間；其二本發創造通過設計庫crrna的混合檢測反應體系的策略，優化檢測體系，優化提高了crispr/cas12a非擴增檢測核酸靈敏度低下的問題。

技術特征：

1.一種非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒及檢測方法，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的一種crispr/cas12a非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒，其特征在于，所述crrna文庫是通過分析肺炎支原體核酸序列的保守性，采用crispr-era軟件設計獲得的crrna文庫序列。

3.一種crispr/cas12a肺炎支原體核酸的檢測方法，基于上述權利要求1-2任一項所述的crispr/cas12a非擴增crispr/cas12a肺炎支原體核酸檢測盒，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

4.根據權利要求3所述的一種crispr/cas12a肺炎支原體核酸的檢測方法，其特征在于，所述步驟s01中所述提取樣本中的dna的提取方法為磁珠法。

5.根據權利要求3所述的一種crispr/cas12a肺炎支原體核酸的檢測方法，其特征在于，所述步驟s03中不同濃度的dna溶液包括10000pm、1000pm、100pm、10pm、1pm、0.1pm、0.01pm。

6.根據權利要求3所述的一種crispr/cas12a肺炎支原體核酸的檢測方法，其特征在于，所述步驟s04、所述步驟s05以及所述步驟s06中執行crispr/cas12a反應體系包括加入濃度為3μl的buffer、加入濃度25nm~30nm的cas12酶、使用單鏈雙光標記dna（ssdna）探針的濃度300~450nmnm、target1、target2和target3的dna終濃度10000pm、1000pm、100pm、10pm、1pm、0.1pm、0.01pm，而每個crrna的濃度為300nm~450nm，最后補入h2o?使得液體的總體積保持在30?μl。

技術總結
本發明公開了一種非擴增CRISPR/Cas12a肺炎支原體核酸檢測盒及檢測方法，涉及醫學檢測領域，所述檢測盒包括：肺炎支原體P1片段的保守序列對應的crRNA文庫；CRISPR/Cas12a反應體系，其包括Buffer、Cas12a酶和單鏈雙光標記DNA（ssDNA）探針；熒光檢測試紙。該發明采用文庫crRNA文庫的非擴增CRISPR/Cas12a肺炎支原體核酸檢測新策略，在不增加檢測核酸分子底物濃度的條件下可有效增加檢測靶點，增加非特異性切割產生的熒光信號，從而有效提高檢測的靈敏度。

技術研發人員：周建,李卓
受保護的技術使用者：西安醫學院第一附屬醫院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28