本發明涉及核酸或微生物的測定或檢驗，尤其涉及用于檢測生殖道病原體的組合物及其制備方法和應用。

背景技術：

1、性傳播疾病（sex?transmitted?disease,?std）指主要通過性接觸、類似性行為及間接傳播的一組傳染性疾病，全球發現的std有30余種，其中具有代表性的有：人型支原體、解脲支原體、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、單純皰疹病毒2型、白色念珠菌、杜克雷嗜血桿菌、陰道毛滴蟲、生殖支原體、梅毒螺旋體和陰道卡氏菌。

2、std是在全世界范圍內流行的一組常見傳染病，近20年來逐漸呈現出流行范圍擴大、發病年齡降低、無癥狀或輕微癥狀患者增多和耐藥菌株數增多的趨勢，已成為全人類必須共同面對的公共健康問題。性傳播感染多無明顯癥狀或缺乏癥狀，及時檢測診斷有利于疾病的確診和治療。分子檢測方法具有零窗口期、高靈敏度等優勢，是多數病原體檢測的金標準。

3、分子診斷方法有助于提高檢測病原體基因的速度和準確性，這對醫院和社區環境中的感染控制、預防、治療很有意義。目前分子診斷方法主要是聚合酶鏈反應（pcr），包括普通pcr、等位基因pcr、實時熒光定量pcr、pcr-sanger測序技術、pcr-基因芯片技術、pcr導流雜交技術等。其中，實時熒光定量pcr可以在單個試管中利用多組引物和探針來同時擴增數個目標dna序列。這項技術自推出以來，因其在靈敏度、和準確度上具有顯著優勢，因此在核酸檢測的眾多領域如突變識別、轉基因檢測、遺傳性疾病的診斷以及病原體辨識等方面被廣泛采用。然而，對于同時檢測多種病原體，多組引物之間的干擾會導致假陽性出現，影響檢測，無法有效檢測或區分多種病原體；且進行多重pcr體系構建時，通常會受限于儀器熒光通道數量；分管進行構建的話，也會增加試劑成本，操作也比較麻煩。

技術實現思路

1、本發明提供一種用于檢測生殖道病原體的組合物及其制備方法，用于在單管內實現多種生殖道病原體的檢測。

2、第一方面，本發明提供一種用于檢測生殖道病原體的組合物，所述組合物包括檢測淋病奈瑟菌的第一組合物、檢測沙眼衣原體的第二組合物、檢測解脲脲原體的第三組合物、檢測微小脲原體的第四組合物、檢測人型支原體的第五組合物、檢測生殖支原體的第六組合物、檢測單純皰疹病毒2型的第七組合物；

3、所述第一組合物、第二組合物、第三組合物、第四組合物、第五組合物、第六組合物和第七組合物中均包括正向引物、反向引物和探針；

4、所述正向引物和反向引物用于擴增靶dna；所述反向引物3’端起第i個核苷酸和第（i+1）個核苷酸之間添加阻斷基團，4≤i≤8，且i為正整數；

5、所述探針滿足如下條件：

6、1)所述探針為單鏈核酸分子；

7、2)所述探針的第一端的第1位核苷酸標記有熒光基團，所述探針的第一端起第n個核苷酸標記有第一淬滅基團，所述探針的第二端的第1位核苷酸標記有第二淬滅基團，9≤n≤30，n為正整數，且n小于所述探針的核苷酸總數；

8、3)所述探針的部分核苷酸序列與所述反向引物3’端起第1個核苷酸至第i個核苷酸之間的核苷酸序列相同；

9、4)所述探針不與所述正向引物結合；

10、5)所述探針不與所述反向引物結合。

11、在本發明中，所述靶dna是指與靶核酸片段對應的dna片段，靶核酸片段可以為dna或rna，靶核酸片段是指存在于待檢測病原體基因中特定區域的一段具有一定的可以作為檢測目標的核酸片段，該核酸片段可以與其他病原體或待檢測樣品自身基因序列有明顯區別。對于遺傳物質為dna的病原體，所述靶核酸片段為靶dna；對于遺傳物質為rna的病原體，所述靶核酸片段逆轉錄后得到所述靶dna。

12、在本發明中，所述病原體是指能夠引起宿主（如人類、動物、植物等）疾病的生物或物質，例如病毒、衣原體、立克次體、支原體、細菌、螺旋體和真菌等微生物和寄生蟲等。在一種具體實施方式中，所述病原體為微生物。進一步地，所述微生物的遺傳物質可以為dna。

13、在本發明中，所述靶dna為雙鏈dna，所述正向引物能夠與靶dna中的一條鏈特異結合，所述反向引物能夠與靶dna中的另一條鏈特異結合，在dna聚合酶的作用下以雙鏈dna為模板進行延伸反應。所述正向引物和反向引物均為單鏈dna。

14、在本發明中，所述正向引物和反向引物的設計原則與本領域常規正向引物和反向引物的設計原則相同或相似，區別在于，本發明在所述反向引物3’端起第i個核苷酸和第（i+1）個核苷酸之間添加阻斷基團，4≤i≤8，且i為正整數（i為4、5、6、7、8中的一個），同時i小于所述反向引物的核苷酸總數；當使用上述正向引物和反向引物對靶dna進行pcr擴增時，正向引物與靶dna的模板鏈結合并進行延伸，遇到阻斷基團后延伸停止，得到一條鏈長度小于另一條鏈的雙鏈擴增產物。

15、進一步地，所述反向引物的核苷酸總數可以為18-35個核苷酸。

16、在本發明中，所述探針可以為單鏈dna分子。

17、在本發明中，所述第一端可以為探針的5’末端，相應的，所述第二端即為所述探針的3’末端；所述第一端還可以為探針的3’末端，相應的，所述第二端即為所述探針的5’末端。

18、在本發明中，n可以為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30中的任一種。

19、在本發明中，所述探針的部分核苷酸序列與所述反向引物3’端起第1個核苷酸至第i個核苷酸之間的核苷酸序列相同。進一步地，所述探針中與所述反向引物相同的核苷酸序列應當靠近所述探針的兩端，以便于和雙鏈擴增產物中長度較短的dna鏈結合，提高結合率。更進一步地，所述探針中與所述反向引物相同的核苷酸序列靠近所述探針的3’端，即位于所述探針中被兩個淬滅基團修飾的核苷酸之間。

20、本發明中，上述結合是指探針不會與正向引物或反向引物互為模板進行pcr擴增，即在不添加靶dna或者待檢測樣品不含有相應病原體的情況下，探針保持卷曲狀態，標記在所述探針第一端的熒光基團所發出的熒光信號會被任意一個淬滅基團吸收，進而無法檢測到相應的熒光信號。當pcr體系中存在至少兩種正向引物和反向引物時，探針也不與靶向其他靶dna的引物對結合。

21、如上所述的組合物，所述探針的長度為20-60nt；gc含量在40%-60%。

22、如上所述的組合物，所述阻斷基團為c3?spacer、c6?spacer、c9?spacer、c12spacer中的至少一種。

23、如上所述的組合物，所述熒光基團選自fam（羧基熒光素）、joe（羧基二甲基熒光素）、tamra（四甲基羅丹明）、rox（羅丹明?x）、cy3、cy5、vic、hex（六氯熒光素）中的至少一種。

24、如上所述的組合物，所述淬滅基團選自bhq1、bhq2中的至少一種。

25、在一種具體實施方式中，所述第一組合物包括用于檢測淋病奈瑟菌的第一正向引物、第一反向引物和第一探針；所述第二組合物包括用于檢測沙眼衣原體的第二正向引物、第二反向引物和第二探針；所述第三組合物包括用于檢測解脲脲原體的第三正向引物、第三反向引物和第三探針；所述第四組合物包括用于檢測微小脲原體的第四正向引物、第四反向引物和第四探針；所述第五組合物包括用于檢測人型支原體的第五正向引物、第五反向引物和所述第一探針；所述第六組合物包括用于檢測生殖支原體的第六正向引物、第六反向引物和所述第四探針；所述第七組合物包括用于檢測單純皰疹病毒2型的第七正向引物、第七反向引物和所述第二探針；

26、所述第一正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:1所示的單鏈dna；

27、所述第二正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:3所示的單鏈dna；

28、所述第三正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:5所示的單鏈dna；

29、所述第四正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:7所示的單鏈dna；

30、所述第五正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:9所示的單鏈dna；

31、所述第六正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:11所示的單鏈dna；

32、所述第七正向引物是核苷酸序列為seq?id?no:13所示的單鏈dna；

33、所述反向引物的結構通式如式1所示：

34、5’-n(a)-y-n(b)-3’?式1

35、式1中，n(a)、n(b)為核苷酸序列不同的多核苷酸片段，y為阻斷基團；

36、所述第一反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:2,n(b)的核苷酸序列為gcccgta；

37、所述第二反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:4,n(b)的核苷酸序列為gcagga；

38、所述第三反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:6,n(b)的核苷酸序列為aagacc；

39、所述第四反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:8,n(b)的核苷酸序列為gacgg；

40、所述第五反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:10,n(b)的核苷酸序列為ctttac；

41、所述第六反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:12,n(b)的核苷酸序列為ggccaa；

42、所述第七反向引物中，n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:14,n(b)的核苷酸序列為ctcca；

43、所述第一探針是核苷酸序列為seq?id?no:17的單鏈dna，且seq?id?no:17的第1位核苷酸標記有第一熒光基團，第25位核苷酸標記有第一淬滅基團，第45位核苷酸標記有第二淬滅基團；

44、所述第二探針是核苷酸序列為seq?id?no:18的單鏈dna，且seq?id?no:18的第1位核苷酸標記有第二熒光基團，第27位核苷酸標記有第三淬滅基團，第46位核苷酸標記有第四淬滅基團；

45、所述第三探針是核苷酸序列為seq?id?no:19的單鏈dna，且seq?id?no:19的第1位核苷酸標記有第三熒光基團，第27位核苷酸標記有第五淬滅基團，第43位核苷酸標記有第六淬滅基團；

46、所述第四探針是核苷酸序列為seq?id?no:20的單鏈dna，且seq?id?no:20的第1位核苷酸標記有第四熒光基團，第26位核苷酸標記有第七淬滅基團，第40位核苷酸標記有第八淬滅基團。

47、本發明中，所述生殖道病原體包括淋病奈瑟菌（ neisseria?gonorrhoeae，ng）、沙眼衣原體（ chlamydia?trachomatis，ct）、解脲脲原體（ ureaplasma?urealyticum，uur）、微小脲原體（ ureaplasma?parvum，upa）、人型支原體（ mycoplasma?hominis，mh）、單純皰疹病毒2型（ herpes?simplex?virus?type?2，hsv-2）和生殖支原體（ mycoplasma?genitalium，mg）中的至少一種。

48、本發明所涉及的原理如圖1所示，具體地：當靶雙鏈dna存在的情況下，本發明提供的正向引物和反向引物與靶dna結合并延伸產生預擴增產物，預擴增產物包括一條長度較短的dna鏈和一條長度較長的dna鏈；同時，探針可與預擴增產物中長度較短的dna鏈通過堿基互補配對結合，并沿該dna鏈5’到3’的方向繼續進行pcr擴增，隨著pcr擴增的進行，探針結構發生改變（主要是熒光基團和淬滅基團之間距離的改變），使得熒光基團發出的熒光信號無法被淬滅基團吸收，熒光信號可被儀器檢測到。當靶雙鏈dna不存在的情況下，探針保持卷曲狀態，熒光基團發出的熒光信號被淬滅基團吸收，熒光信號無法被檢測。通過觀察是否有熒光信號，即可判斷是否有靶雙鏈dna的存在，確定待檢測樣品是否含有對應病原體。受限于儀器熒光通道數量的限制，本發明提供的探針可同時實現兩種靶標病原體的檢測，通過熔解曲線分析，結合靶標pcr產物的不同tm值，實現兩種病原體的定性檢測。

49、以沙眼衣原體為例對上述檢測過程進行說明：本發明提供的用于檢測沙眼衣原體的靶dna的核苷酸序列如seq?id?no:22所示；針對上述靶dna，本發明提供的正向引物的核苷酸序列為5’-?ggtagatccgatatcagcaaaagtgctcc?-3’（seq?id?no:3），反向引物的核苷酸序列為5’-?gtgccaccttatttgctgcagga?-3’（前17個核苷酸序列為seq?id?no:4），且在5’端起第17位核苷酸（t）與第18位核苷酸（g）之間連接阻斷基團，探針的核苷酸序列為5’-?ccacgccacgtcagacaaacgaacgctggcaggaccactccctcca?-3’（seq?id?no:18），且5’端起第1位核苷酸（c）標記有熒光基團，第27位核苷酸（t）標記有第一淬滅基團，第46位核苷酸（a）上標記有第二淬滅基團。當使用上述正向引物和反向引物對靶dna進行pcr擴增后，得到的預擴增產物包括核苷酸序列為5’-?ggtagatccgatatcagcaaaagtgctcctaaaggaagattccttcggtatcctgc-3’的dna鏈（seq?id?no:29），該dna鏈3’端起第1位核苷酸至第6位核苷酸（如上述序列中下劃線所示）與探針5’端起第29位核苷酸至第34位核苷酸（如上述序列中下劃線所示）通過互補配對結合，由于探針的3’端標記有熒光淬滅基團，無法引發dna聚合酶的延伸反應，因此，所述dna鏈充當引物的作用，以探針為模板進行延伸發生二次pcr擴增，第二次擴增產物與探針形成雙鏈結構，熒光基團發出的熒光信號無法被淬滅基團吸收，熒光信號被檢測，表明靶dna存在。

50、如上所述的組合物，還包括用于檢測內參基因的組合物。在一種具體實施方式中，所述內參基因可以為人β-肌動蛋白（beta-actin,?β-actin?）對應的靶標dna。進一步地，人β-肌動蛋白對應的靶標dna的核苷酸序列為seq?id?no:28。基于該靶標dna，用于檢測人β-肌動蛋白對應靶標dna的組合物包括第八正向引物、第八反向引物和探針，其中，所述第八正向引物的核苷酸序列為seq?id?no:15；所述第八反向引物的結構如式1所示，且n(a)的核苷酸序列為seq?id?no:16,n(b)的核苷酸序列為cacga；所述探針為第三探針。

51、如上所述的組合物，所述正向引物與反向引物的摩爾比大于等于3：1，提高能夠與探針結合的擴增產物鏈。進一步地，所述正向引物與反向引物的摩爾比為3：1-10：1，具體可以為3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10：1或介于其中的任意兩者組成的范圍之內。更進一步地，所述正向引物與反向引物的摩爾比為10：1。

52、需要說明的是，本發明中正向引物和反向引物是指靶向同一靶dna的引物對，例如第一正向引物與第一反向引物的摩爾比大于等于3：1，對于第一正向引物和第二反向引物的摩爾比，本發明不作特別限定。

53、如上所述的組合物，所述正向引物在組合物中的摩爾濃度為90-1000nm，具體可以為90nm、100?nm、150?nm、200?nm、250?nm、300?nm、350?nm、400?nm、450?nm、500?nm、550?nm、600?nm、650?nm、700?nm、750?nm、800?nm、850?nm、900?nm、950?nm、1000?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內。

54、如上所述的組合物，所述反向引物在組合物中的摩爾濃度為30-100?nm，具體可以為30nm、35nm、40nm、45?nm、50?nm、55?nm、60?nm、65?nm、70?nm、75?nm、80?nm、85?nm、90?nm、95?nm、100?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內。

55、如上所述的組合物，所述探針在組合物中的摩爾濃度為100-1000?nm，具體可以為100?nm、150?nm、200?nm、250?nm、300?nm、350?nm、400?nm、450?nm、500?nm、550?nm、600?nm、650?nm、700?nm、750?nm、800?nm、850?nm、900?nm、950?nm、1000?nm或介于其中的任意兩者組成的范圍之內。

56、需要說明的是，上述正向引物、反向引物和探針的濃度均為一種引物和探針的濃度，即第一正向引物在組合物中的濃度為90-1000nm，第一反向引物在組合物中的濃度為30-100?nm，第一探針在組合物中的濃度為100-1000?nm。

57、第二方面，本發明提供上述任一所述組合物的制備方法，包括：

58、s1、提供上述組合物中的正向引物、反向引物和探針；

59、s2、將所述正向引物、反向引物和探針組合得到所述組合物。

60、如上所述的方法，上述正向引物、反向引物和探針均可通過本領域常規方法合成得到。

61、第三方面，本發明提供一種用于檢測生殖道病原體的試劑盒，包括上述任一所述的組合物。

62、第四方面，本發明提供上述任一所述的組合物和/或上述試劑盒的應用，所述應用選自a1)-a2)中的任一種：

63、a1)在檢測生殖道病原體中的應用；

64、a2)在制備檢測生殖道病原體的產品中的應用。

65、第五方面，本發明提供一種檢測生殖道病原體的方法，包括：

66、制備待檢測樣品的dna；

67、使用上述任一所述的組合物或上述試劑盒對所述dna進行實時熒光定量pcr，確定待檢測樣品是否含有生殖道病原體。

68、如上所述的方法，所述dna可以通過本領域常規的dna提取試劑盒進行。

69、如上所述的方法，根據探針攜帶的熒光基團的不同，可首先通過檢測熒光信號確定待檢測樣品是否含有待檢測病原體，例如，如果檢測到相應的熒光信號，則說明待檢測樣品中含有待檢測病原體，如果未檢測到相應的熒光信號，則說明待檢測樣品中不含有待檢測病原體；對于淋病奈瑟球菌和人型支原體的確定，當存在與第一探針的熒光信號時，可以通過tm值確定待檢測樣品中是否含有淋病奈瑟球菌和/或人型支原體。

70、如上所述的方法，所述方法的直接目的可為非疾病診斷和/或非疾病治療目的。上述應用或方法為非疾病診斷的應用或方法。上述應用或方法不以獲得有生命的人體或動物體的疾病診斷結果或健康狀況為直接目的。

71、如上所述的方法，所述方法為非疾病治療目的的應用或方法。上述方法不以使有生命的人體或者動物體恢復或獲得健康或減少痛苦為直接目的。

72、如上所述的方法，所述待檢測樣品可為來自非有生命的人體或動物體的樣品，如環境樣品（如空氣）、衣物或毛巾或作為食品的動物組織和/或器官等。

73、本發明基于七種常見的生殖道病原體，提供了靶向七種生殖道病原體的正向引物和反向引物，以及四種通用探針，通過擴增產物的靶序列與探針雜交后改變探針的構象而發出熒光，結合tm值確定是否含有病原體以及病原體的種類，在單管內實現了七種生殖道病原體的多重定性檢測，有效避免多重檢測過程中假陽性的問題，為疾病的診斷和防控提供技術支持。