本發明屬于發酵，具體涉及一種發酵法生產丁二酸的方法。

背景技術：

1、丁二酸，又稱琥珀酸，是一種重要的二元有機酸，常溫常壓下為無色結晶體，具有良好的水溶性和穩定性；

2、丁二酸的應用范圍較為廣泛，在食品領域，丁二酸主要是作為酸味劑、緩沖劑、防腐劑、ph調節劑等；在醫藥領域，還可以用來合成解毒劑、利尿劑、鎮靜劑和、止血藥以及維生素等；在化工領域，丁二酸是一種良好的表面活性劑，可以用于潤滑劑、添加劑以及彈性體中，還可以作為生產聚酯、聚氨酯的重要原料；在農業領域，丁二酸可以用于生產植物生長調節劑和肥料。

3、微生物發酵法因其綠色、可持續的特點成為研究熱點，現有的發酵法生產丁二酸的方法主要有以下兩種：

4、一是通過對微生物進行基因改造，增強其代謝途徑中關鍵酶的活性，但是基因工程菌的穩定性較差，在長期發酵過程中，影響發酵的穩定性，最終影響丁二酸的產量；

5、二是采用天然微生物作為發酵菌株，以糖類等作為底物進行發酵，在發酵體系中還會加入特定的誘導劑，以促進微生物的代謝活動，但是其存在發酵效率低，丁二酸產量低的缺陷。

6、cn117187309a公開了利用蔗渣發酵制備丁二酸的方法，具體是對蔗渣進行稀酸水解和脫毒，得到脫毒水解液，菌種經活化培養后，加入脫毒水解液進行發酵培養，經后處理得到丁二酸；所得發酵成熟醪液中殘糖含量為0.85-1.36g/l，丁二酸含量為52.03-56.64g/l，丁二酸產率為62.3-66.8%；

7、上述專利的發酵方法，發酵周期較長，制得發酵液中丁二酸含量仍然較低，不利于大規模的工業化生產。

技術實現思路

1、為了解決現有技術存在的技術問題，本發明提供了一種發酵法生產丁二酸的方法，縮短發酵周期，提高發酵液中的丁二酸含量，提高丁二酸的生產效率。

2、針對上述技術問題，本發明出采取以下技術方案：

3、一種發酵法生產丁二酸的方法，包括秸稈預處理、發酵培養以及后處理步驟，具體如下：

4、1.秸稈預處理

5、（1）堿洗

6、將玉米秸稈烘干至水分含量為0.8-1.4wt%，然后粉碎至粒徑為100-130目，投入至密閉容器中，通入6-12倍質量的氫氧化鈉溶液，升高溫度至104-114℃，保溫處理3.6-4.2h，保溫處理結束后，濾出固體物，采用去離子水洗滌至ph為7.0-7.5，干燥后，得到堿洗秸稈；

7、所述氫氧化鈉溶液的質量濃度為12-18%；

8、（2）二次處理

9、將堿洗秸稈投入至超臨界二氧化碳裝置中，控制處理溫度為44-52℃，處理壓力為12.3-12.8mpa，處理時間為2.0-2.6h，處理結束后，加入至8-14倍質量的處理劑中，升高溫度至102-108℃，在620-680rpm下，保溫密閉處理3.2-3.7h，處理結束后，在1400-1700rpm下離心8-15min，經過濾洗滌后干燥，制得二次處理秸稈；

10、所述處理劑是氯化膽堿、甘油和l-谷氨酸的混合物，所述氯化膽堿、甘油和l-谷氨酸的質量比為1.8-2.4:2.0-2.7:1.0-1.5；

11、（3）酶解

12、向二次處理秸稈中加入至8-14倍質量的ph值為4.8-5.2的1.5-2.0wt%檸檬酸鈉緩沖液中，然后加入纖維素酶和木聚糖酶，每克二次處理秸稈中18-23fpiu纖維素酶、26-32fpiu/木聚糖酶，在46-52℃下酶解40-45h，得到初級酶解液，將初級酶解液升高溫度至102-108℃，保溫處理8-16min，冷卻后，經過濾，得到酶解液。

13、2.發酵培養

14、（1）菌種活化

15、將大腸桿菌接種至液體培養基中，在33-36℃、130-160rpm下活化培養11.0-15.0h，然后按照體積分數1.6-2.2%的接種量接種到活化培養基，在32-37℃、106-128rpm下培養18.0-24.0h，得到活化培養液；

16、所述大腸桿菌由市場購買所得；

17、所述液體培養基是由胰蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉4.6-5.4g/l、氯化銨5.7-6.4g/l、氯化鈉9.5-10.2g/l組成；

18、所述活化培養基是由葡萄糖9-13g/l、酵母浸粉8-13g/l、玉米漿4.6-5.3g/l、碳酸氫鈉6.2-6.8g/l、磷酸氫二鉀8-13g/l組成；

19、（2）發酵

20、將活化培養液按照體積分數4.6-5.3%的接種量接種到發酵培養基中，調節ph至6.5-7.0，在35-38℃的混合氣氛中，405-430rpm下振蕩培養，當發酵液中還原糖含量降低至4.5-5.2g/l時，補加發酵培養基中的酶解液至還原糖濃度為20-25g/l，在發酵培養至第20-23h時，流加發酵促進液75-82g/l，控制流加時間為9.5-10.2h，發酵培養57.2-58.5h，得到發酵液；

21、所述混合氣氛為二氧化碳和氫氣，所述二氧化碳與氫氣的體積比為90-94:6-10；

22、所述發酵培養基是由初級發酵培養基和酶解液組成，所述初級發酵培養基和酶解液的體積比為1:0.8-1.3；

23、所述發酵培養基是由葡萄糖12.0-12.5g/l、酵母浸粉9.4-10.2g/l、玉米漿干粉3.2-3.8g/l磷酸氫二鉀7.2-7.7g/l、磷酸二氫鉀2.2-2.8g/l、氯化銨3.7-4.3/l、卡拉膠0.3-0.6g/l、鉬酸鈉0.40-0.45mg/l、硫酸錳2.0-2.5mg/l、硫酸鎂1.0-1.5g/l組成；

24、所述發酵促進液是去離子水、γ-氨基丁酸、維生素b2、吲哚乙酸的混合物，所述去離子水、γ-氨基丁酸、維生素b2、吲哚乙酸的質量比為1000g：0.23-0.28g:0.04-0.08g:0.10-0.14mg。

25、3.后處理

26、將發酵液過濾，濾液經離心后收集上清液，然后減壓濃縮至原來體積的32-40%，得到濃縮液；將濃縮液降低溫度至3.8-4.4℃，保溫靜置47-54h，經過濾后干燥，得到丁二酸產品。

27、與現有技術相比，本發明取得了以下有益效果：

28、1.本發明采用特定的方法發酵生產丁二酸，采用大腸桿菌作為發酵菌劑，采用植物秸稈作為發酵基體，先是對植物秸稈進行堿洗，破壞秸稈中的木質纖維素結構，溶解部分木質素，使得纖維素和半纖維素充分暴露，然后進行超臨界二氧化碳處理，其可以滲透到秸稈的細胞壁中，使得細胞壁膨脹，破壞纖維素與半纖維素之間的連接，增加秸稈之間的孔隙率，然后采用處理劑進行處理，處理劑中的氯化膽堿作為氫鍵受體，甘油和l-谷氨酸作為氫鍵供體，其組成的處理劑具有較好的溶解性和生物相容性，其能夠滲入纖維素和半纖維素的結晶區域，破壞其氫鍵網絡結構，使得纖維素和半纖維素變得松散，增加其與酶的接觸面積，從而更好的實現酶解，使得秸稈中的大分子糖轉變為可發酵性糖，為丁二酸的發酵生產提供了營養源；在發酵步驟中，卡拉膠不僅可以作為碳源，還可以調節微生物的生長環境，其形成的凝膠網絡有助于營養液和代謝產物的分布更加均勻；發酵促進液中的γ-氨基丁酸可以較好的調節細胞代謝和傳導，增強細胞的抗逆性，結合維生素b2、吲哚乙酸，為丁二酸合成途徑中的酶提供充足的能量和還原力，促進丁二酸的合成反應，從而提高丁二酸的產量和生產效率，降低了副產物的生成；

29、2.對本發明得到的發酵液進行測試，測得丁二酸含量為68.5-72.3g/l，乙酸含量為0.941.18g/l，乳酸含量為1.22-1.36g/l。