本發明屬于生命科學與生物，涉及一種人線粒體基因甲基化雜交捕獲測序發方法，尤其涉及一種人線粒體基因組甲基化的檢測方法及應用，是利用高通量測序來測定人類線粒體基因甲基化狀態與疾病發生發展的關系。

背景技術：

1、在人的基因組上，dna甲基化主要發生在cg上。基因組上cpg密度高的區域被稱為cpg島，cpg島在基因的啟動子區和第一個外顯子區有顯著的富集。cpg島的甲基化可以通過調節染色質結構和轉錄因子來調節相關基因的表達或沉默。研究表明，位于基因轉錄調控區附近的cpg島的dna甲基化狀態常與疾病的發生發展密切相關。

2、線粒體是半自主性細胞器，有其自身的線粒體dna(mtdna)復制、轉錄和蛋白質翻譯的全套裝備。線粒體dna上的甲基化首次被發現于19世紀70年代。隨后，一系列的研究報道了線粒體dna上存在著低于核基因組水平的甲基化。但越來越多的研究表明，線粒體dna甲基化與多種疾病的發生發展密切相關。在腫瘤組織中，線粒體dna甲基化的水平普遍顯著升高，而且這種升高與腫瘤的發生、發展密切相關。線粒體dna甲基化與糖尿病、心血管疾病等多種疾病也有著密切的關系。此外，線粒體dna甲基化還與細胞代謝活動相關，會引起線粒體功能障礙，能量代謝紊亂，導致多種疾病的發生。

3、近年來，針對于線粒體基因甲基化的檢測，國內相繼研發了線粒體甲基化的檢測方法，以滿足對相關疾病進行線粒體甲基化的研究，如一個申請的一種人類線粒體基因組甲基化檢測試劑盒及其應用(專利申請號：cn201810597493.x)，該發明是利用亞硫酸鹽修飾、pcr擴增技術以及芯片點樣及質譜檢測方法進行檢測，只檢測出線粒體基因組內292個cpg位點，具有一定的應用價值。但是該方法只反應了部分線粒體基因序列的甲基化情況，尚未完全檢測線粒體全基因組整體甲基化。另一個申請的用于線粒體-細胞核dna甲基化聯合位點的篩選方法和應用(專利申請號：cn201710771772.9)，僅僅是對線粒體dna上322、3636、9994和13431這四個位點去甲基化水平的檢測。還有一個申請的是利用轉座酶對染色質開放區和線粒體甲基化研究的方法(專利申請號：cn201810040939.9)，該發明是利用轉座酶對染色質開放區和線粒體甲基化進行研究的一種方法，并且只對線粒體基因組1209位點進行了檢測，由于核基因和線粒體基因存在同源序列，對其中甲基化假陽性和假陰性問題尚未闡述。

4、本研究中所采取的線粒體dna甲基化捕獲測序技術采用后硫化捕獲技術方案，即先構建線粒體基因組重亞硫酸鹽文庫，再進行線粒體基因組全區域捕獲，獲得上機文庫后進行高通量測序，避免了模板多樣性的丟失，上機測序和生物學分析，計算出線粒體基因組甲基化的情況。

技術實現思路

1、本發明的目的是針對目前線粒體dna甲基化技術存在的缺點，提供一種人線粒體基因組甲基化的檢測方法，是一種針對線粒體dna雙鏈cg位點進行雙態設計，避開重復序列，確保捕獲效率，依據探針序列熱力學穩定性調整探針劑量的探針設計理念；一種金標準的重亞硫酸鹽硫化轉化，轉化效率穩定且可有效降低假陽性率的建庫方案；一種具有自主研發的有效提高捕獲效率的特異組分增強子和支持多雜方案的接頭通用封阻序列的高度優化的雜交捕獲體系。

2、本發明提供的一種人線粒體基因組甲基化的檢測方法，即一種基于高通量測序技術檢測線粒體dna甲基化的方法，由線粒體基因組提純、超聲打斷線粒體dna、重亞硫酸鹽硫化處理、探針設計和線粒體dna區域捕獲、上級測序及分析等5個組分構成。具體操作步驟如下：

3、(1)線粒體基因組提純、打斷：收集全血或者細胞樣本，采用密度梯度法進行線粒體分離，然后進行線粒體dna提純；采用超聲隨機打斷的方式將線粒體基因組dna打斷(150-200bp)，基因組dna片段末端修復加a，接頭連接，純化；

4、(2)甲基化接頭連接：在配制好的甲基化接頭反應體系中對線粒體dna片段進行甲基化接頭連接，甲基化接頭p5端序列5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct，p7端序列：/5phos/gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac；

5、(3)重亞硫酸鹽處理：在重亞硫酸鹽轉化反應體系中加入線粒體dna保護液，保護液主要成分為1×sspe預雜交溶液、5×denhardt溶液、0.01mol/l的乙二胺四乙酸溶液和0.2％的十二烷基硫酸鈉溶液；在pcr儀器設置重亞硫酸鹽處理參數，進行重亞硫酸鹽處理；所述的線粒體dna保護液，保證了線粒體dna甲基化狀態；

6、(4)探針設計、線粒體全基因組捕獲：針對線粒體基因組雙鏈cg位點進行雙態設計，降低成本的同時保證甲基化檢出率；探針設計基于熱力學穩定性進行疊瓦式設計，根據捕獲效率、均一性和覆蓋率的需求，選擇最佳的探針覆蓋方案；同時，針對高gc區域和串聯重復區域，采用加密探針和選擇側翼探針的策略；針對基因組同源序列較多的情況，可根據非特異性評估結果及對捕獲效率的影響推薦合適的探針設計方案；同時，探針設計根據最新參考基因組grch38及grc官網最新補丁序列設計探針，可有效減少因個體差異引起的漏檢，捕獲所需的線粒體dna甲基化探針組分共計512條。然后將線粒體dna甲基化探針與文庫進行雜交，鏈霉親和素磁珠捕獲線粒體dna甲基化文庫。

7、(5)捕獲后進行文庫富集純化，其中pcr擴增反應中涉及的擴增引物為，通用接頭正向引物5’-aatgatacggcgaccaccga；反向引物：5’-caagcagaagacggcatacga；得到線粒體dna甲基化特異性文庫，將文庫進行擴增富集、質檢，得到符合上機測序的線粒體dna甲基化終文庫。

8、(6)上機測序，下機后進行生物信息分析：去除低質量讀數及重復序列，完成讀數利用bsmap比對至參考基因組grch38/hg38，使用methyldackel計算cpg,chg,chh的甲基化水水平。

9、步驟(4)中探針設計覆蓋了整個線粒體基因組，將不同捕獲反應的cgi探針數據進行相關性分析，線粒體dna甲基化捕獲技術檢測線粒體dna甲基化水平的技術重復性很好，r2達到了0.99。

10、步驟(4)中針對線粒體基因組調控區，進行雙鏈cg位點雙態設計，探針用量僅為常規探針的2倍，保證甲基化檢出率的同時，節省探針，降低成本。

11、本發明提供的甲基化雜交捕獲體系基于成熟的區域捕獲體系開發，使用單管操作，僅需兩種漂洗試劑，實驗更簡便，多雜表現穩定，對不同大小的探針表現穩定。搭配自主研發增強子，有效提高捕獲效率，均一性和穩定性表現卓越。

12、本發明所述的檢測方法在人線粒體基因組甲基化檢測中應用。本發明針對線粒體dna雙鏈cg位點進行雙態設計，顯著降低因個體差異引起的漏檢風險，不僅降低了檢測成本，同時有效提高了甲基化的檢出率。

13、本發明提供的探針設計理念是針對雙鏈cg位點進行雙態設計，可降低成本并保證甲基化檢出率；采用自動最優序列選擇，避開重復序列，確保捕獲效率；依據探針序列熱力學穩定性調整探針劑量，確保高均一性。

14、在本發明提供的高度優化的雜交捕獲體系，高度優化的實驗流程，確保高均一性和穩定性；自主研發的接頭通用封阻序列，支持多雜方案，進一步降低實驗成本。

15、本發明的線粒體dna甲基化捕獲測序技術采用重亞硫酸鹽處理后捕獲方案，即先構建全基因組重亞硫酸鹽文庫，再進行線粒體基因組甲基化域捕獲，獲得上機文庫后進行高通量測序，避免了模板多樣性的丟失。

16、本發明的線粒體dna甲基化檢測方法及其制備具有以下顯著特征：

17、1.本研究采用高通量線粒體dna甲基化雜交捕獲測序方法，針對線粒體dna雙鏈cg位點進行雙態設計，此設計不僅降低了檢測成本，同時有效提高了甲基化的檢出率。

18、2.目前國內外已存在多種線粒體dna甲基化檢測方法，如芯片點樣及質譜檢測等。然而，這些方法通常面臨費時、操作復雜及檢測成本偏高等缺陷，限制了其在臨床應用中的推廣。相比之下，本發明提供的高通量檢測方法有效避免了假陽性、假陰性及低通量等問題，顯著提升了檢測的靈敏度和特異性。

19、3.線粒體dna甲基化探針的設計基于最新的參考基因組grch38及grc官網更新的補丁序列，從而顯著降低因個體差異引起的漏檢風險，進一步增強了本方法的可靠性和準確性。