本發明涉及山羊痘病毒的，尤其涉及一種提高山羊痘病毒含量的培養方法。

背景技術：

1、山羊痘是由山羊痘病毒引發的急性、熱性、接觸性傳染病。該病一年四季均可發生，經常在沒有免疫的敏感山羊群中爆發，病羊和病愈帶毒羊是主要傳染源，病毒常存在于痘皰液、痘皰痂皮和分泌物中，隨脫落的痂皮和分泌物而污染周圍環境、飼料和飲水等，通過損傷的粘膜傳染疫病，也可通過羊虱等吸血昆蟲間接傳播。發病率可達100%，死亡率一般不高，但惡性羊痘可高達50%以上。羔羊最易感、病死率較高，人也可感染山羊痘。

2、發病初期羊體溫升高達39.5～41.5℃，精神沉郁，結膜潮紅；有的呆立或臥地不起，從鼻孔流出漿液性、粘液性、膿性分泌物，呼吸、脈搏增速；少數羊食欲下降、飲水量減少，多數羊采食、飲水停止。2～4天后，病羊全身皮膚，特別是乳房、口唇、四肢內側等少毛或無毛區，出現黃豆或蠶豆大小的紅斑，并發展成凸出于皮膚表面的實硬丘疹；有的羊病變部丘疹相互融合，使皮膚凹凸不平。若加強飼養管理和對癥治療，無繼發感染，病羊體溫逐漸轉向正常，食欲逐步恢復，轉歸痊愈；若體況較差，飼養管理不良或繼發感染，可引起死亡。

3、疫苗免疫是防制山羊痘的最好方法。目前山羊痘疫苗主要為弱毒活疫苗，將山羊痘種毒接種bhk細胞，收獲細胞培養物，加入適宜凍干穩定劑，經冷凍真空干燥制成。

技術實現思路

1、本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

2、鑒于上述現有提高山羊痘病毒含量的培養方法存在的問題，提出了本發明。

3、因此，本發明目的是提供一種提高山羊痘病毒含量的培養方法，其通過優化細胞培養過程中的l-谷氨酰胺濃度、海藻糖濃度等關鍵成分，有效促進了bhk細胞的生長，并提高了山羊痘病毒的增殖速度和產量。

4、為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：一種提高山羊痘病毒含量的培養方法，包括以下步驟：

5、步驟一：健康細胞培養：將凍存的bhk細胞復蘇傳代，基礎培養基為含5%新生牛血清的dmem培養基，分成5組，每組1只t75方瓶，繼續傳代培養；

6、步驟二：繼續傳代的培養基中分別加入l-谷氨酰胺（0～4mm），每次傳代時取1瓶按1:8比例分瓶，棄其余7瓶，待細胞長成致密單層時用0.25%胰酶溶液消化，再分瓶培養；每組均傳3代，觀察每次每組細胞長成致密單層的時間；

7、步驟三：山羊痘病毒培養：在bhk細胞生長液中均加入2mm的l-谷氨酰胺，按常規方法消化分散傳代，擴繁到40瓶細胞，分成5組接種山羊痘病毒，每組8瓶，每瓶加入25ml病毒維持液；

8、步驟四：每組病毒維持液中均含有2%新生牛血清、2mm?l-谷氨酰胺、2%種毒，另加入不同濃度的海藻糖；

9、步驟五：將生長良好的bhk細胞棄去生長液，山羊痘毒種按維持液總量的1%～2%接種bhk細胞，加入細胞維持液，置37℃培養，每天觀察1～2次，當病變達到75%以上時收獲，取樣檢測病毒含量；

10、步驟六：將山羊痘病毒液用無血清dmem培養基作10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋度，接種96孔細胞板，每個稀釋度接種5孔，每孔0.1ml，接種后每孔加入每毫升含20萬～30萬vero細胞懸液0.1ml，37℃、5%?培養箱培養3～5日，每日觀察細胞病變，第5日判定，根據出現細胞病變的細胞孔數計算山羊痘病毒的tcid50。

11、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：山羊痘毒種為山羊痘睪丸細胞培養弱毒株;病毒含量測定用?vero?細胞。

12、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：生產和病毒含量測定均用dmem培養基，在細胞培養液中加入5%新生牛血清，維持液中加入2%新生牛血清。

13、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：步驟二中加入l-谷氨酰胺能夠加速bhk細胞分裂，促進其生長，加入2mm的l-谷氨酰胺對bhk細胞效果最好，按1:8比例分瓶，44小時能夠長成致密單層，比不加谷氨酰胺的細胞快22小時。

14、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：l-谷氨酰胺單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中，且加有l-谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入l-谷氨酰胺，培養液中l-谷氨酰胺的含量為1-4mm，配制200mm?l-谷氨酰胺液儲存，用時加入培養液中。

15、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：步驟四中病毒含量為107.0tcid50/ml。

16、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：病毒維持液中加入海藻糖能夠明顯促進山羊痘病毒的增殖，加快其病變進程，提高山羊痘病毒含量，加入6-8mg/ml的海藻糖效果最佳，其病變時間比不加海藻糖縮短16小時以上，病毒含量提高1.21滴度以上。

17、作為本發明提高山羊痘病毒含量的培養方法的一種優選方案，其中：l-谷氨酰胺、海藻糖用于bhk細胞培養、山羊痘病毒的培養增殖，促進和提高山羊痘疫苗的產量和質量。

18、本發明的有益效果：

19、1、提高病毒產量：通過優化細胞培養過程中的l-谷氨酰胺濃度、海藻糖濃度等關鍵成分，有效促進了bhk細胞的生長，并提高了山羊痘病毒的增殖速度和產量。

20、2、優化細胞培養環境：采用含有5%新生牛血清的dmem培養基以及適當濃度的l-谷氨酰胺，能夠為bhk細胞提供良好的生長環境，確保細胞能夠在短時間內達到最佳狀態，從而提高病毒的培養效率。

21、3、提高病毒感染效率：在培養過程中加入海藻糖等添加劑，有助于提高病毒對細胞的感染能力，增強病毒的復制效率。海藻糖的添加尤其有助于提高病毒在bhk細胞中的穩定性和增殖能力。

22、4、縮短培養周期：通過細胞傳代次數的控制與培養基的優化，可以減少細胞生長所需的時間，并提高病毒的感染和增殖效率，從而縮短病毒收獲周期。

23、5、提高病毒定量檢測精度：通過對病毒液體的10倍系列稀釋后接種vero細胞，能夠精準測定病毒的tcid50，確保病毒培養過程中的病毒濃度能夠滿足后續疫苗生產和實驗需求。

技術特征：

1.一種提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：山羊痘病毒的毒種為山羊痘睪丸細胞培養弱毒株；病毒含量測定用vero細胞。

3.根據權利要求2所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：生產和病毒含量測定均用dmem培養基，在細胞培養液中加入5%新生牛血清，維持液中加入2%新生牛血清。

4.根據權利要求1所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：所述步驟二中加入l-谷氨酰胺能夠加速bhk細胞分裂，促進其生長，加入2mm的l-谷氨酰胺對bhk細胞效果好，按1:8比例分瓶，44小時能夠長成致密單層，比不加谷氨酰胺的細胞快22小時。

5.根據權利要求4所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：所述l-谷氨酰胺單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中，且加有l-谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入l-谷氨酰胺，所述培養液中l-谷氨酰胺的含量為1-4mm，配制200mm?l-谷氨酰胺液儲存，用時加入培養液中。

6.根據權利要求1所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：所述步驟四中病毒含量為107.0tcid50/ml。

7.根據權利要求6所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：所述病毒維持液中加入海藻糖能夠明顯促進山羊痘病毒的增殖，加快其病變進程，提高山羊痘病毒含量，加入6-8mg/ml的海藻糖效果最佳，其病變時間比不加海藻糖縮短16小時以上，病毒含量提高1.21滴度以上。

8.根據權利要求5所述的提高山羊痘病毒含量的培養方法，其特征在于：所述l-谷氨酰胺、海藻糖用于bhk細胞培養、山羊痘病毒的培養增殖，促進和提高山羊痘疫苗的產量和質量。

技術總結
本發明公開了一種提高山羊痘病毒含量的培養方法，包括以下步驟：步驟一：健康細胞培養：將凍存的BHK細胞復蘇傳代至一定數量，基礎培養基為含5%新生牛血清的DMEM培養基，繼續傳代培養；步驟二：繼續傳代的培養基中分別加入L?谷氨酰胺（0～4mM），每次傳代時取1瓶按1:8比例分瓶；步驟三：山羊痘病毒培養：在BHK細胞生長液中均加入2mM的L?谷氨酰胺，按常規方法消化分散傳代，擴繁到40瓶細胞；步驟四：每組病毒維持液中均含有2%新生牛血清、2mM?L?谷氨酰胺，另加入不同濃度的海藻糖。本發明在培養過程中加入海藻糖等添加劑，有助于提高病毒對細胞的感染能力，增強病毒的復制效率，通過細胞傳代次數的控制與培養基的優化，提高病毒的感染和增殖效率。

技術研發人員：吉梅,張傳明,欒智翔,汪鑫,張文霞
受保護的技術使用者：中海生物制藥（泰州）有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24