本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是涉及一種car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、對于胃癌的治療，放療和化療等傳統(tǒng)治療方法往往伴有嚴重的副作用和疾病復(fù)發(fā)。因此，迫切需要更加個性化的治療策略。利用免疫系統(tǒng)的巨大潛力似乎是改善胃癌患者治療結(jié)果的新希望。

2、使用嵌合抗原受體工程t細胞（car-t細胞）的免疫療法在白血病治療中效果顯著，對于胃癌等實體瘤，實體組織致密結(jié)構(gòu)會導致car-t細胞治療效果不佳等，類器官模型很好的模擬了實體瘤致密結(jié)構(gòu)，雖然也有少量研究利用腫瘤類器官研究car-t細胞殺傷功能，但目前沒有針對胃癌的car-t細胞殺傷功能檢測。此外，腫瘤組織中過表達的抗體可能在正常組織中也表達，可能導致嚴重副作用，現(xiàn)有的研究都是對car-t細胞的殺傷性進行驗證，忽略了car-t細胞安全性檢測。因此，如何構(gòu)建更加全面的檢測car-t細胞治療胃癌效果的臨床前模型，是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，以同時對car-t細胞的殺傷性和car-t細胞的安全性進行檢測，從而得到更加全面的檢測car-t細胞治療胃癌效果的臨床前模型。

2、本發(fā)明的一方面提供一種car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，所述car-t細胞的胃癌治療效果評估模型包括car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系、以及car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系；

3、所述car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系通過以下步驟得到：

4、步驟s11，將胃癌類器官在基質(zhì)膠及胃癌類器官培養(yǎng)基中培養(yǎng)為三維結(jié)構(gòu)；

5、步驟s12，用磷酸鹽緩沖液將胃癌類器官從膠中分離，用cell?mask染料進行染色，使胃癌類器官帶紅色熒光；

6、步驟s13，用dio染料將car-t細胞進行染色，使其帶綠色熒光；

7、步驟s14，將染色后的胃癌類器官與car-t細胞混合，得到混合細胞重懸液；

8、步驟s15，通過共培養(yǎng)的培養(yǎng)基對混合細胞重懸液進行培養(yǎng)，得到car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系；

9、所述car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系通過以下步驟得到：

10、步驟s21，將腸類器官與car-t細胞混和，得到混合細胞重懸液a，將肺類器官與car-t細胞混和，得到混合細胞重懸液b，將腸類器官與對照t細胞混和，得到混合細胞重懸液c，將肺類器官與對照t細胞混和，得到混合細胞重懸液d；

11、步驟s22，利用共培養(yǎng)的培養(yǎng)基a分別對混合細胞重懸液a、混合細胞重懸液c進行培養(yǎng)，利用共培養(yǎng)的培養(yǎng)基b分別對混合細胞重懸液b、混合細胞重懸液d進行培養(yǎng)，從而得到car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系。

12、本發(fā)明的另一方面提供了上述構(gòu)建方法得到的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的應(yīng)用，所述car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系用于檢測car-t細胞的殺傷性，所述car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系用于評估car-t細胞的安全性。

13、具體的，在檢測car-t細胞的殺傷性時，使用活細胞成像顯微鏡對car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系拍攝預(yù)設(shè)時間，觀測car-t細胞作用于胃癌類器官的作用方式；

14、在評估car-t細胞的安全性時，先對培養(yǎng)后的混合細胞重懸液a、混合細胞重懸液b、混合細胞重懸液c、混合細胞重懸液d進行pi染色，并用顯微鏡拍攝，然后用磷酸緩沖液將car-t細胞及腸類器官共培養(yǎng)物從膠中分離并清洗、將car-t細胞及肺類器官共培養(yǎng)物從膠中分離并清洗，將對照t細胞及腸類器官共培養(yǎng)物從膠中分離并清洗，將對照t細胞及肺類器官共培養(yǎng)物從膠中分離并清洗，再使用tryple分別將清洗后的各個共培養(yǎng)物消化為單細胞，然后采用epcam抗體對單細胞進行標記，再流式檢測pi及epcam雙陽的細胞，比對car-t細胞及對照t細胞對腸類器官和肺類器官的殺傷情況，評估car-t細胞安全性。

15、有益效果：

16、本發(fā)明構(gòu)建的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型包括car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系、以及car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系，基于car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系，可以采用活細胞成像法對car-t細胞作用于胃癌類器官的過程進行動態(tài)觀察，進而研究car-t細胞治療實體瘤的作用機制，同時，基于car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系，可以檢測car-t細胞對于胃癌旁組織及其他組織來源類器官的作用，進行安全性評估，因此，本發(fā)明得到了更加全面的檢測car-t細胞治療胃癌效果的臨床前模型，有利于car-t細胞靶標的研究。

技術(shù)特征：

1.一種car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述car-t細胞的胃癌治療效果評估模型包括car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系、以及car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s21具體包括：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s22具體包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s11中，胃癌類器官培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；青霉素-鏈霉素混合液，1x；b27，1x；glumax補充劑，1mm；乙酰半胱氨酸，1x；hepes?buffer，1x；n2，1x；b27，200ng/ml；wnt3a，1μg/ml；r-spondin?1，100ng/ml；noggin，10nm；胃泌素蛋白gastrin，10nm；egf，50ng/ml；纖維生長因子fgf-10，100ng/ml；tgf-β?i型受體抑制劑a83-01，0.5μm；煙酰胺，10mm；y-27632，10μm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s15中，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；青霉素-鏈霉素混合液，1x；b27，1x；glumax補充劑，1mm；乙酰半胱氨酸，1x；hepes?buffer，1x；n2，1x；b27，200ng/ml；wnt3a，1μg/ml；r-spondin?1，100ng/ml；noggin，10nm；胃泌素蛋白gastrin，10nm；egf，50ng/ml；纖維生長因子fgf-10，100ng/ml；tgf-β?i型受體抑制劑a83-01，0.5μm；煙酰胺，10mm；y-27632，10μm；il-2，200u/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s211中，腸類器官培養(yǎng)基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；egf，50ng/ml；igf?1，100ng/ml；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；胃泌素蛋白gastrin，10?nm；fgf2，50ng/ml；wnt-3a?無血清條件培養(yǎng)基，50%；b27?補充液，1x；n-acetylcysteine，1mm；nicotinamide，5mm；glutamax，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin，100μg/ml；y-27632，5μm；r-spondin?1，500ng/ml；

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s22中，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基a的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；egf，50ng/ml；igf?1，100ng/ml；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；胃泌素蛋白gastrin，10?nm；fgf2，50ng/ml；wnt-3a?無血清條件培養(yǎng)基，50%；b27?補充液，1x；n-acetylcysteine，1mm；nicotinamide，5mm；glutamax，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin，100μg/ml；y-27632，5μm；r-spondin?1，500ng/ml；il-2，200u/ml；

8.權(quán)利要求1至7任一項所述的構(gòu)建方法得到的car-t細胞的胃癌治療效果評估模型的應(yīng)用，其特征在于，所述car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系用于檢測car-t細胞的殺傷性，所述car-t細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系用于評估car-t細胞的安全性。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，在檢測car-t細胞的殺傷性時，使用活細胞成像顯微鏡對car-t細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系拍攝預(yù)設(shè)時間，觀測car-t細胞作用于胃癌類器官的作用方式；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種CAR?T細胞的胃癌治療效果評估模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建的CAR?T細胞的胃癌治療效果評估模型包括CAR?T細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系、以及CAR?T細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系，基于CAR?T細胞與胃癌類器官共培養(yǎng)殺傷性動態(tài)檢測體系，可以采用活細胞成像法對CAR?T細胞作用于胃癌類器官的過程進行動態(tài)觀察，進而研究CAR?T細胞治療實體瘤的作用機制，同時，基于CAR?T細胞與腸類器官及肺類器官共培養(yǎng)安全性評估體系，可以檢測CAR?T細胞對于胃癌旁組織及其他組織來源類器官的作用，進行安全性評估，因此，本發(fā)明得到了更加全面的檢測CAR?T細胞治療胃癌效果的臨床前模型，有利于CAR?T細胞靶標的研究。

技術(shù)研發(fā)人員：陳曄光,熊敬維,李思奇
受保護的技術(shù)使用者：南昌大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28