一種快速檢測羊水中胎兒細(xì)胞vhl基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及羊水胎兒細(xì)胞VHL基因突變檢測的方法和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] VHL基因（M頂編號608537)定位于3p25-26,全長10KD，包含三個外顯子和兩個內(nèi) 含子，可轉(zhuǎn)錄形成兩種mRNA。包含三個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA翻譯出p30 (213個氨基酸） 和pl9 (159個氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二轉(zhuǎn)錄起始位點（54號密碼子）轉(zhuǎn)錄形成 的異構(gòu)體，與p30功能相似。
[0003] VHL基因突變方式多樣，包括點突變、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位點突 變等。目前檢測VHL基因突變最常用的方法是PCR直接測序，準(zhǔn)確率為38 %~80 %，這是 由于PCR測序檢測技術(shù)只能檢測點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變，不能檢測VHL 基因大片段缺失，然而VHL大片段缺失的發(fā)生率為11%~40%。目前國內(nèi)外用于VHL基因 大片段缺失檢測的方法包括印記雜交法SouthernBlot、多重連接探針擴增技術(shù)MLPA、逆轉(zhuǎn) 錄法RT-PCR及通用引物熒光定量PCR法UPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有檢測 方法操作繁瑣，價格昂貴，不適于推廣應(yīng)用等缺陷，且上述VHL基因突變的檢測樣本多為外 周血，目前還沒有對羊水中胎兒細(xì)胞的VHL基因進行檢測的方法，一方面由于提取羊水時， 羊水中可能會受到母體遺傳物的污染，影響檢測結(jié)果；另一方面，目前的應(yīng)用于外周血等檢 測樣本的VHL基因檢測方法，檢測周期長，檢測成本高，不利于VHL基因的快速準(zhǔn)確的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種操作簡單、檢測 快速、結(jié)果準(zhǔn)確且成本低廉的胎兒細(xì)胞VHL基因突變檢測方法和試劑盒。
[0005] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種快速檢測羊水中胎兒細(xì)胞VHL基因 突變的方法，包括：
[0006] 通過提取羊水中胎兒細(xì)胞的DNA，獲得DNA溶液；
[0007] 對所述的DNA溶液進行母體遺傳物質(zhì)污染的檢測，判斷DNA溶液中是否存在母體 遺傳物質(zhì)污染；
[0008] 若判斷DNA溶液中不存在母體遺傳物質(zhì)污染，則直接對胎兒細(xì)胞進行VHL基因突 變檢測；
[0009] 若判斷DNA溶液中存在母體遺傳物質(zhì)污染，則對羊水中胎兒細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代后 再進行VHL基因突變檢測。
[0010] 其中，所述母體遺傳物質(zhì)污染檢測包括：
[0011] 人工合成人類性別決定基因SRY和X染色體上的3個短串聯(lián)重復(fù)序列DXS6797、 DXS6807、AR的擴增引物對1-4 ;
[0012] 利用所述擴增引物對1-4和所述DNA溶液建立PCR擴增反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)， 得到PCR擴增產(chǎn)物；
[0013] 對所述PCR擴增產(chǎn)物中的SRY基因擴增產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，對所述 PCR擴增產(chǎn)物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的擴增產(chǎn)物進行STR分析，根據(jù)所述SRY基 因擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果和STR分析結(jié)果判斷所述DNA溶液中是否存在母體遺傳物質(zhì)污染。
[0014] 其中，所述利用所述擴增引物對1-4和所述DNA溶液建立的PCR擴增反應(yīng)體系是： 總體積為25y1，包括12. 5y1的PCRmix、20-80ng的DNA模板、0. 5y1的擴增引物和余量 的CldH2O;反應(yīng)條件是：在95°C溫度條件下預(yù)變性5min;95°C變性20s，SRY基因、DXS6797、 DXS680755°C退火 20s，AR58°C退火 20s，72°C延伸 20s，30 個循環(huán)后 72°C復(fù)性 5min，4°C保 存。
[0015] 特別是，所述擴增引物對1-4如SEQIDNO. 1-8所示，分別為：
[0024] 其中，所述擴增引物對2中DXS6797-F引物的5'端標(biāo)記FAM熒光。
[0025] 其中，所述擴增引物對3中DXS6807-F引物的5'端標(biāo)記FAM熒光。
[0026] 其中，所述擴增引物對4中AR-F引物的5 '端標(biāo)記FAM熒光。
[0027] 其中，所述VHL基因突變檢測包括：
[0028] 采用熒光原位雜交探針對所述羊水中胎兒細(xì)胞進行VHL基因大片段缺失的檢測， 獲得所述胎兒細(xì)胞是否存在大片段缺失的檢測結(jié)果。
[0029] 特別是，所述熒光原位雜交探針上標(biāo)有熒光信號，由具有SEQIDNO. 15-20所示的 堿基序列的探針引物對8-10進行PCR制備得到。
[0030] 其中，所述探針引物對8-10如SEQ
ID NO. 15-20所示的堿基序列，包括：
[0037] 其中，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行PCR制備 得到的雜交探針的大小為300_1000bp。
[0038] 進一步優(yōu)選地，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行 PCR制備得到的雜交探針的大小為300-800bp。
[0039] 進一步優(yōu)選地，所述由具有SEQ ID NO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行 PCR制備得到的雜交探針的大小為300-500bp。
[0040] 其中，所述采用熒光原位雜交探針對所述胎兒細(xì)胞進行VHL基因大片段缺失的檢 測包括：
[0041] 利用已采集的羊水中胎兒細(xì)胞制備細(xì)胞涂片；
[0042] 將所述熒光原位雜交探針置于雜交液中與所述細(xì)胞發(fā)生雜交反應(yīng)，獲得雜交產(chǎn) 物；
[0043] 洗滌所述雜交產(chǎn)物，并進行細(xì)胞核染色，獲得核染色后的細(xì)胞涂片；
[0044] 通過熒光顯微鏡觀察所述核染色后的細(xì)胞涂片，判斷待測樣本的DNA是否發(fā)生了 VHL基因大片段缺失。
[0045] 其中，所述利用已采集的羊水中胎兒細(xì)胞制備細(xì)胞涂片還包括：對采集得到的羊 水中胎兒細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代。
[0046] 特別是，所述對羊水中的細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代是指在預(yù)先配制的胎兒細(xì)胞培養(yǎng)液中 進行培養(yǎng)傳代，其中培養(yǎng)溫度為37°C，空氣中0)2的體積百分比為5%。
[0047] 特別是，所述胎兒細(xì)胞培養(yǎng)液由70-79%的hyclonedmem/fl2培養(yǎng)基、20-28%胎 牛血清FBS和1-2%的青霉素和鏈霉素雙抗PS配制而成。
[0048] 優(yōu)選地，所述胎兒細(xì)胞培養(yǎng)液由74%的hyclonedmem/fl2培養(yǎng)基、25%胎牛血清 FBS、1 %的青霉素和鏈霉素雙抗PS配制而成。
[0049] 其中，所述制備細(xì)胞涂片的步驟包括：通過離心獲得待測樣本中的細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽 緩沖液離心和KCl低滲處理后，用固定液固定所述細(xì)胞的形態(tài)，制成細(xì)胞涂片；將所述細(xì)胞 涂片進行老化處理，經(jīng)胃蛋白酶消化處理后，進行酒精梯度脫水，得到細(xì)胞涂片。
[0050] 其中，所述固定液是由體積比為3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。
[0051] 其中，所述雜交液是是由體積比為5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配 制而成。
[0052] 其中，所述老化處理是將所述細(xì)胞涂片在56°C條件下在烤片機上處理20min。
[0053] 其中，所述老化處理還可以是在15_30°C的室溫條件下過夜放置12_16h。
[0054] 特別是，所述采用熒光原位雜交探針對所述胎兒細(xì)胞進行VHL基因大片段缺失的 檢測還包括：熒光原位雜交探針的制備。
[0055] 其中，所述熒光原位雜交探針的制備包括：在人類基因組中篩選用作FISH探針的 VHL基因序列，通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段；將得到的基因片段連接到質(zhì)粒 中，獲得含有目的基因片段的質(zhì)粒；將所述質(zhì)粒在大腸桿菌中進行擴增，提取質(zhì)粒后，得到 質(zhì)粒溶液；利用探針引物對8-10、熒光原料和所述質(zhì)粒溶液制備具有熒光染料標(biāo)記的熒光 原位雜交探針。
[0056] 其中，所述克隆引物對11-13如SEQIDNO. 21-26所示的堿基序列，包括：
[0063] 其中，所述通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段的反應(yīng)體系是
[0064] 反應(yīng)物體積
[0065]PCRmix25U1
[0066]DNA模板IOOng
[0067]引物2yl
[0068] ddH20 余量
[0069] 總體積 50U1。
[0070] 其中，所述通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性 lOmin，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 個循環(huán)，72°C復(fù)性 7min，4°C保存。
[0071] 其中，所述將得到的基因片段連接到質(zhì)粒中的反應(yīng)體系是：T-vector0. 7y1，PCR 產(chǎn)物 5yI，T4 連接酶IyI，T4ByfferIyI，CldH2O余量，總體積 10y1。
[0072] 其中，所述將得到的基因片段連接到質(zhì)粒中的反應(yīng)條件是：在室溫條件下反應(yīng) 2h〇
[0073] 其中，所述利用探針引物、熒光原料和所述質(zhì)粒溶液制備具有熒光染料標(biāo)記的熒 光原位雜交探針的反應(yīng)體系為：
[0076] 其中，所述利用探針引物、熒光原料和所述質(zhì)粒溶液制備具有熒光染料標(biāo)記的熒 光原位雜交探針的反應(yīng)條件為：94°(：預(yù)變性21^11，94°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸 458,30個循環(huán)，72°(：復(fù)性1〇111111，4°(：保存。得到熒光原位雜交探針。
[0077] 其中，所述熒光原位雜交探針的濃度是約8_20ng/ y 1。
[0078] 優(yōu)選的，所述熒光原位雜交探針的濃度是約10_15ng/ y 1。
[0079] 其中，所述雜交反應(yīng)的共變性溫度是70_80°C，共變性反應(yīng)時間是5-10min。
[0080]優(yōu)選地，所述雜交反應(yīng)的共變性溫度是73-76°C，共變性反應(yīng)時間是7-8min。
[0081] 其中，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度是40-46°C，雜交時間是14-18h。
[0082]優(yōu)選地，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度是42-44°C，雜交時間是16h。
[0083] 其中，所述VHL基因突變檢測還包括：
[0084] 采用VHL基因的三個外顯子VHL-UVHL-2和VHL-3的擴增引物對5-7對所述DNA 溶液進行VHL基因點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變的檢測，獲得所述DNA溶液中 是否存在點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變的檢測結(jié)果。
[0085] 其中，所述VHL基因的三個外顯子VHL-I、VHL-2和VHL-3的擴增引物對5-7如SEQ IDNO. 9-14所示，分別為：
[0092] 尤其是，所述采用VHL基因的三個外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴增引物對所 述D