本發明屬于納米材料，具體涉及一種梳狀聚氨酯包裹的磁性微球及其制備方法。

背景技術：

1、目前磁性微球被廣泛應用于生物、醫學領域。例如作為遞送藥物的藥物載體，用于診斷目的免疫沉淀及化學發光免疫檢測等，用于使目標物分離的蛋白純化、核酸純化、細胞分離的運輸載體等。總體來說，磁性微球通過表面的功能基團吸附結合或共價結合這兩種方式與目標物結合來實現上述功能。吸附結合依靠聚合物磁性微球表面功能基團提供的非特異性吸附力，例如，功能基團多聚胸腺嘧啶(oligo?dt)可以特異性吸附多聚腺苷酸(polya)，所以用表面帶有oligo?dt功能基團的聚合物磁性微球特異結合帶有poly?a“尾巴”的mrna，將mrna從總rna中分離出來。而共價結合依靠聚合物磁性微球表面的功能基團與蛋白、抗體上的官能團進行的反應形成。例如免疫檢測中常使用代有羧基或苯甲磺酰基等活性功能基團的聚合物磁性微球與蛋白質、抗體分子中的氨基進行偶聯。羧基或苯甲磺酰基等活性功能基團偶聯具有親和性的蛋白質的蛋白a、蛋白g的聚合物磁性微球被用于抗體的親和純化等。

2、磁性微球的廣泛使用也對其本身提出了更高的要求。首先，要求磁性微球是超順磁響應并非永久磁化的；其次，要求順磁性晶體被嚴密的包覆，防止在使用過程從磁性微球中浸出超順磁性晶體或鐵離子；第三，功能基團與包覆膜之間需要有足夠密度和長度的親水性間隔臂，用以保證在磁性微球表面不發生非特異性吸附；第四，功能基團需要有足夠的密度和活性，尤其是表面功能基團提供吸附力的磁性微球需要有足夠的功能基團密度，而依靠表面的功能基團共價結合蛋白、抗體的磁性微球需要有足夠的功能基團活性。

3、中國專利文獻cn1849512a公開了一種包覆的磁性顆粒的制備方法，其在美國專利文獻us?4654267的基礎上公開了兩種聚合物包覆含有超順磁晶體微球的聚合物包覆方法，一種是使用兩種環氧化合物反應形成聚醚膜層包覆多孔、表面官能化、含超順磁性晶體的聚合物微球；另一種是使用二異氰酸酯和聚乙二醇反應得到聚氨酯膜層包覆多孔、表面官能化、含超順磁性晶體的聚合物微球。但是這兩種包覆方式均有不足：首先，環氧化合物形成的聚醚膜層可以有效防止磁性晶體暴露或脫落并提供了親水性的連接臂，但聚醚形成的膜層的親水性良好，不能抑制離子擴散，限制聚合物磁性微球在較低ph下的應用。例如，蛋白a(protein?a)磁珠在吸附抗體后，在ph?3.0-3.5解析，使用聚醚包覆的蛋白a(proteina)磁珠會造成鐵離子泄露。二異氰酸酯和聚乙二醇反應得到的聚氨酯膜層相對疏水，可以有效防止離子擴散，同時用于擴鏈的聚乙二醇提供了一定長度的親水性連接臂，但其活性位點僅分布于大分子聚氨酯的一端，造成下一步反應得到的功能基密度低，這一問題限制了聚合物磁性微球在吸附結合方向上的應用。

4、中國專利文獻cn108192007a在cn1849512a的基礎上做出了一部分的改進，其合成方式相比于cn1849512a使用帶有羧基的多元醇或氨基酸，對端基為異氰酸酯的聚氨酯進行擴鏈，在線性聚氨酯主鏈上引入羧基，增加了羧基密度，但由于聚氨酯主鏈和羧基之間沒有間隔臂存在，存在蛋白偶聯效率低，非特異性吸附大的問題。

5、日本專利文獻jp2007127426a公開了一種聚合物包覆磁性微球的方法，其使用兩次溶脹聚合對含有含超順磁性晶體的聚合物微球進行疏水、親水兩層包覆的方式解決磁性晶體或離子泄露、功能基團密度低和線性聚合物膜層在溶劑中的溶脹問題。相比于cn1849512a，jp2007127426a使用可溶脹、多孔、含超順磁性晶體的聚合物微球與疏水性的丙烯酸酯或苯乙烯類單體、交聯劑進行首次溶脹聚合形成疏水膜層，該膜層可以有效仿制磁性晶體或離子泄露；再用親水性或含有功能性基團的單體、交聯劑再進行第二次溶脹聚合，該膜層提供充足的親水性連接臂或功能基團。但是其使用兩次溶脹聚合的包覆方法會使聚合物磁性微球粒徑增加、表面積降低，影響磁珠的應用效果，例如增加粒徑的聚合物磁性微球用于蛋白載體會出現蛋白載量偏低，用于化學發光法免疫檢測會出現發光值偏低；此外為了維持合理的粒徑和表面積，其使用了更小粒徑的模板微球進行兩次溶脹聚合包覆，這會顯著增加聚合物磁性微球的制備難度；更為關鍵的是其使用的溶脹聚合方式會將單體擴散至“模板”微球內部，為了保證包覆效果，用于“包覆”的聚合物與“模板”微球的重量比遠大于cn1849512a這種僅在微球表面進行包覆的方式，這會帶來的順磁性晶體重量占比降低，磁性微球磁響應變差的問題。

技術實現思路

1、因此，本發明要解決的技術問題在于現有技術中使用過程容易從磁性微球中浸出超順磁性晶體或鐵離子，功能基團沒有足夠的密度和活性，磁性微球表面容易發生非特異性吸附的缺陷，從而提供了一種梳狀聚氨酯包裹的磁性微球及其制備方法。

2、為此，本發明采用如下技術方案：

3、本發明提供一種梳狀聚氨酯包裹的磁性微球的制備方法，包括如下步驟：

4、s1：將磁性微球、二異氰酸酯類單體、包括不飽和二元醇單體的二元醇單體混合反應，得到不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球；

5、s2：在所述不飽和線性聚氨酯上的不飽和鍵上反應生成側鏈，得到所述梳狀聚氨酯包裹的磁性微球；

6、所述生成側鏈的反應為聚合劑和不飽和線性聚氨酯上的不飽和鍵進行的聚合反應；

7、或，所述生成側鏈的反應為偶聯劑和不飽和線性聚氨酯上的不飽和鍵進行的偶聯反應。

8、進一步地，步驟s1中，先將磁性微球和二異氰酸酯類單體混合反應，然后加入二元醇單體進行反應；磁性微球和二異氰酸酯類單體溫度為0-100℃，反應時間為10-120min，攪拌速度為50-300rpm，磁性微球和二異氰酸酯類單體的質量比為1：(0.1～10)。優選地，反應溫度為20-50℃，反應時間為10-60min，磁性微球和二異氰酸酯類單體的質量比為1：(0.3-5)。

9、加入二元醇單體后進行的反應包括第一反應和第二反應；

10、所述第一反應的溫度為40-120℃，反應時間為4-24小時，攪拌速度為50-300rpm，加入的二元醇單體物質的量之和與二異氰酸酯類單體的摩爾比為(0.1-0.5):1；

11、所述第二反應的溫度為80-120℃，反應時間為1-8小時，攪拌速度為50-300rpm，加入的二元醇單體物質的量之和與二異氰酸酯類單體的摩爾比為(1-6):1。優選地，所述第一反應的溫度為60-100℃，反應時間為16-24小時，加入的二元醇單體的量之和與二異氰酸酯類單體的摩爾比為(0.2-0.3333):1；所述第二反應的溫度為80-100℃，反應時間為1-4小時，加入的二元醇單體的物質的量之和與二異氰酸酯類單體的摩爾比為(2-4):1。

12、所述二元醇單體中，飽和二元醇單體與不飽和二元醇單體的摩爾比為(0-109):1，優選的摩爾比為(0-106):1，更優選的摩爾比為(0-103):1；

13、不飽和二元醇單體、飽和二元醇單體和二異氰酸酯類單體的分子量均不超過2000da，優選均不超過1000da，更優的為100-600da。不飽和二元醇單體、飽和二元醇單體和二異氰酸酯類單體構成的聚氨酯大分子分子量不低于1kda，優選的聚氨酯大分子分子量不低于5kda。

14、步驟s2中，當生成側鏈的反應為聚合反應時，具體反應為將所述聚合劑與引發劑和不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球在20-90℃反應2-24小時，所述不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球與所述聚合劑的質量比為1：(0.2-10)，所述聚合劑與引發劑的質量比為1：(0:001-0.1)；

15、當生成側鏈的反應為偶聯反應時，具體反應為將所述偶聯劑與引發劑不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球在在20-80℃反應2-24小時，所述不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球與所述偶聯劑的質量比為1：(0.001-10)；所述偶聯劑與引發劑的質量比為1：(0:001-0.1)。

16、優選地，步驟s2中，當生成側鏈的反應為聚合反應時，具體反應為將所述聚合劑與引發劑和不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球在40-80℃反應4-16小時，所述不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球與所述聚合劑的質量比為1：(0.5-5)，所述聚合劑與引發劑的質量比為1：(0:005-0.05)；

17、當生成側鏈的反應為偶聯反應時，具體反應為將所述偶聯劑與引發劑不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球在40-70℃反應4-16小時，所述不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球與所述偶聯劑的質量比為1：(0.001-0.1)；所述偶聯劑與引發劑的質量比為1：(0:005-0.05)。

18、所述二異氰酸酯單體為具有兩個異氰酸酯基團的化合物，包括甲苯二異氰酸酯(tdi)、二苯甲烷二異氰酸酯(mdl)，六亞甲基二異氰酸酯(hdi)、異佛爾酮二異氰酸酯(ipdi)中的至少一種；其最優的有甲苯二異氰酸酯(tdi)、二苯甲烷二異氰酸酯(mdl)，六亞甲基二異氰酸酯(hdi)；

19、所述不飽和二元醇單體為具有不飽和鍵的二元醇，優選為具有雙鍵的二元醇，包括2,4-己二烯-1,6-二醇，2-戊烯-1,5-二醇，1,4-丁烯二醇，2,3-二羥基-1-丁烯，3-烯丙氧基-1,2-丙二醇，2-乙烯基丙烷-1,3-二醇中的至少一種，其最優的是1,4-丁烯二醇，2,3-二羥基-1-丁烯，2-乙烯基丙烷-1,3-二醇，3-烯丙氧基-1,2-丙二醇中的至少一種；

20、所述不飽和二元醇單體是指具有飽和的二元醇，優選為分子量小于600da的二元醇，包括二乙醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇(聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600)中的至少一種；

21、所述聚合劑包括乙烯基類單體、丙烯酸類單體、丙烯酸酯類單體、丙烯酰胺類單體中的至少一種；其中，包括：用于合成羧基磁珠的單體：例如丙烯酸，丙烯酸鈉，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸鈉，3-丁烯酸，4-戊烯酸，馬來酸，2-(丙-2-烯酰氨基)乙酸；

22、用于合成氨基磁珠的單體：例如烯丙基胺鹽酸鹽，4-戊烯-1-胺，3-氨基丙醇乙烯基醚，丙烯酸2-氨基乙基酯鹽酸鹽，甲級丙烯酸2-氨基乙基酯鹽酸鹽，n-(2-氨乙基)丙烯酰胺，n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽；

23、用于合成環氧基磁珠的單體：例如1,2-環氧基-5-己烯，烯丙基縮水甘油醚，丙烯酸-2，3-環氧丙酯，甲基丙烯酸縮水甘油酯；

24、用于合成羥基磁珠的單體：例如丙烯醇，丁烯醇，2-乙烯氧基乙醇，2-乙烯氧基丙醇，丙烯酸羥乙酯，甲基丙烯酸羥乙酯，4-羥基丁基丙烯酸酯，4-羥基丁基甲基丙烯酸酯，n-(2-羥乙基)丙烯酰胺，n-(3-羥丙基)丙烯酰胺，n-(4-羥丁基)丙烯酰胺；

25、所述偶聯劑包括功能基化的聚醚、聚乙二醇、多糖、多肽、蛋白、核酸或寡核酸中的至少一種，優選為包括巰基的聚醚、聚乙二醇、多糖、多肽、蛋白、核酸或寡核酸中的至少一種；其中聚醚、聚乙二醇、多糖這三種一般當做延長臂，利用親水性和羥基結構增加端基和抗體偶聯的效率；多肽、蛋白利用其中的巰基，直接完成偶聯；

26、所述引發劑包括有機過氧化合物、無機過氧化物和偶氮類引發劑中的至少一種。有機過氧化合物包括酰類過氧化物(過氧化苯甲酰、過氧化月桂酰)、氫過氧化物(異丙苯過氧化氫、叔丁基過氧化氫)、二烷基過氧化物(過氧化二叔丁基、過氧化二異丙苯)、酯類過氧化物(過氧化苯甲酸叔丁酯、過氧化叔戊酸叔丁基酯)、酮類過氧化物(過氧化甲乙酮、過氧化環己酮)、二碳酸酯過氧化物(過氧化二碳酸二異丙酯、過氧化二碳酸二環己酯)；過硫酸鹽包括過硫酸鉀、過硫酸鈉、過硫酸銨。偶氮類引發劑包括偶氮二異庚腈(abvn)、偶氮二異戊腈、偶氮二異丁腈、偶氮二環已基甲腈、偶氮異丁氰基甲酰胺、偶氮二異丁脒鹽酸鹽、偶氮二異丁酸二甲酯、偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽、偶氮二氰基戊酸。

27、所述磁性微球為多孔、表面官能化、含有超順磁性晶體的磁性微球，由共沉淀法，氧化沉淀法、還原沉淀法，復聚法或物理吸附法中的任意一種方法制得；所述磁性微球的平均粒徑為0.2-20μm；所述表面官能化的基團為羥基、酚羥基、酯、伯氨、仲氨、脲或酰胺基團中的至少一種，所述基團含量為10-3-10mmol/g；

28、所述超順磁晶體中的鐵元素以質量百分比計，占磁性微球總質量的10-60wt％；

29、所述磁性微球的比表面積為0.5-50m2/g，孔徑為5-50nm，孔隙率為20-80％；

30、優選地，所述磁性微球由共沉淀法，氧化沉淀法或還原沉淀法中的任意一種方法制得；所述磁性微球的平均粒徑為0.5-10μm；所述表面官能化的基團為羥基或氨基基團中的至少一種，所述基團含量為0.05-5mmol/g；所述超順磁晶體中的鐵元素以質量百分比計，占磁性微球總質量的20-50％；所述磁性微球的比表面積為3-30m2/g，孔徑為10-30nm，孔隙率為20-60％。

31、步驟s1反應前，還包括將磁性微球進行磁吸置換的步驟，步驟s1反應后，還包括洗滌和磁吸分離的步驟；具體的，磁吸置換為，將磁性微球加入反應器，并向反應器內加入無水有機溶劑，通過攪拌、超聲等方式將上述磁性微球分散于無水有機溶劑中，通過多次磁吸置換使體系中的水含量降低至1000ppm以下，最終調整上述磁性微球與有機溶劑的重量比為1:(3-40)；洗滌和磁吸分離為，使用微球重量3-40倍的一種或幾種溶劑或溶劑的混合物清洗該磁性微球3-10次，每次洗滌后磁吸分離，去除未與磁性微球反應的不飽和聚氨酯；

32、步驟s2反應前，還包括將不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球進行磁吸置換的步驟，步驟s2反應后，還包括洗滌和磁吸分離的步驟；具體的，磁吸置換為，將不飽和線性聚氨酯包覆的磁性微球加入反應器中，加入有機溶劑、水、水溶液或以上幾種的混合物中，通過攪拌、超聲等方式將上述磁性微球分散于上述溶液中，磁吸置換溶液3-10次，并最終調整上述磁性微球與有機溶劑的重量比為1:(3-40)；洗滌和磁吸分離為，使用微球重量3-40倍的有機溶劑、水、水溶液或以上幾種的混合物對反應后的磁性微球進行洗滌3-10次，每次洗滌后磁吸分離，去除未反應的聚合物。

33、其中有機溶劑是指不與異氰酸酯反應，并以任意比例與水互溶的溶劑，其優選的是丙酮、四氫呋喃、二氧六環、乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚，其最優的為二氧六環、二乙二醇二甲醚，其含水量小于200ppm，優選的含水量小于100ppm，其最優的含水量小于50ppm。

34、水溶液為緩沖鹽的溶液，其目的為ph緩沖。濃度為10-1000mmol/l，ph范圍4-12。其優選的為甲酸-甲酸鹽水溶液，醋酸-醋酸鹽水溶液、檸檬酸-檸檬酸鹽水溶液，磷酸-磷酸鹽水溶液，硼酸-硼酸鹽水溶液，4-甲基嗎啡啉-氫氧化鈉水溶液，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸水溶液，其最優的是磷酸-磷酸鹽水溶液，硼酸-硼酸鹽水溶液，4-甲基嗎啡啉-氫氧化鈉水溶液，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸水溶液。其優選的濃度范圍為20-200mmol/l，ph范圍5-10。

35、本發明還提供一種梳狀聚氨酯包裹的磁性微球，由上述制備方法制得，其側鏈的分子量不低于200da，優選為200da-100kda，更優為200-10kda。

36、本發明技術方案，具有如下優點：

37、(1)本發明采用梳狀聚氨酯包裹的磁性微球，其疏水的聚氨酯主鏈可以防止鐵離子泄露，親水的側鏈可以獲得更為親水的表面性能或更高的配基密度。同時本發明阻止磁性微球過多增長，對磁性微球的粒徑進行控制，防止過大的粒徑造成表面積降低，載量降低。

38、(2)本發明在制備過程中，使用含有雙鍵的聚氨酯主鏈包覆磁性顆粒，主鏈上的雙鍵，用于進一步的聚合或接枝，雙鍵多少可以調整側鏈密度，聚合或接枝的原料、工藝變化可以調整側鏈長度。側鏈的長度、密度調整可以控制聚合物磁性微球表面性能。

39、(3)本發明通過特定的制備工藝制得的梳狀聚氨酯包裹的磁性微球，具有低了鐵離子的泄漏量，高的配基密度和適當的粒徑，降低了非特異性吸附，具有廣泛的應用前景。