本發(fā)明提供一種具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及鈦材表面納米結(jié)構(gòu)化，還涉及生物功能化該納米鈦材。
背景技術(shù)：
：鈦及鈦合金由于具有良好的物理性能已被作為植入體材料并廣泛應(yīng)用于骨科臨床領(lǐng)域。不足之處是其表面存在生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成潛能，以致鈦基植入體與周邊自然骨組織的整合性差，如何提高鈦基植入體與周邊自然骨組織結(jié)合的長期穩(wěn)定性是其臨床應(yīng)用所面臨的普遍問題。目前，為了改善鈦材表面特性，國內(nèi)外研究人員通過模擬自然骨的微米/納米結(jié)構(gòu)，提高鈦材的生物學(xué)效應(yīng)。Brammer和Park等研究證實(shí)二氧化鈦納米管的納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞成骨分化發(fā)揮重要作用（Brammer,2009,Actabiomaterialia&Park,2009,Small）。同時(shí)，二氧化鈦納米管因重復(fù)性好、簡(jiǎn)單易行且具有獨(dú)特的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可作為負(fù)載藥物、生長因子等的載體在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。成骨生長肽，作為一個(gè)可溶性、短線性生長因子肽段，能直接調(diào)控體外細(xì)胞增殖成骨分化和礦化以及體內(nèi)骨形成與骨愈合。Policastro和Moore等研究證實(shí)利用成骨生長肽修飾材料表面和支架能夠表現(xiàn)良好的骨誘導(dǎo)性（Policastro,2015,Biomacromolecules&Moore,2010，Biomaterials)。目前，未見成骨生長肽通過化學(xué)連接用于修飾二氧化鈦納米管提高骨整合性的報(bào)道。此外，Lee等證實(shí)化合物多巴胺能以自我聚合的方式在各自底物表面形成一層聚多巴胺層，通過聚多巴胺的鄰苯二酚與醌基團(tuán)可以將蛋白質(zhì)生長因子等固定在底物表面上（Lee,2007,Science）。本研究目的是探究納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與成骨生長肽對(duì)成骨分化的協(xié)同效應(yīng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是要提供一種具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管及其制備方法，通過表面的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與化學(xué)成分協(xié)同促進(jìn)成骨作用，進(jìn)而提高鈦材的早期骨整合性。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：利用陽極氧化法在鈦材表面合成二氧化鈦納米管，進(jìn)一步通過聚多巴胺將成骨生長肽固定在二氧化鈦納米管表面。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：a、將鈦材按常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理備用；b、利用陽極氧化法在步驟a預(yù)處理后的鈦片表面制備管徑為30-100nm的二氧化鈦納米管陣列；c、在步驟b制得的二氧化鈦納米管陣列表面沉積聚多巴胺；d、通過成骨生長肽溶液與步驟c制得的表面沉積有聚多巴胺的二氧化鈦納米管陣列上，即制得具良好促成骨作用二氧化鈦納米管。4、進(jìn)一步，所述步驟a是將鈦材剪切成(1-2)cm×(1-2)cm的鈦片，依次利用丙酮、無水乙醇和雙蒸水超聲清洗10-30min，并于37-40℃烘箱中烘干備用。5、進(jìn)一步，所述步驟b是以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽極，鉑片為陰極，丙三醇與雙蒸水體積比為1比1配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在10-30V的恒定電壓下電解1-3h，將氧化后的鈦片超聲清洗2-5min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱1-3h，制得管徑為30-100nm的二氧化鈦納米管。6、進(jìn)一步，所述步驟c是利用5-15mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為1-3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，并調(diào)pH至8-9，將步驟b制得的二氧化鈦納米管浸入鹽酸多巴胺溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，然后利用雙蒸水清洗，常溫干燥，制得表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管。7、進(jìn)一步，所述步驟d是利用5-15mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為10-20ng/mL的成骨生長肽溶液，將步驟c所制得的表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管浸入上述成骨生長肽溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，然后利用PBS清洗，常溫干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化鈦納米管。本發(fā)明的有益效果在于：由于采用了上述方案，本發(fā)明通過陽極氧化法在鈦材表面構(gòu)建了二氧化鈦納米管，進(jìn)一步通過聚多巴胺在二氧化鈦納米管表面固定成骨生長肽。一方面，二氧化鈦納米管提供了良好的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；另一方面，成骨生長肽作為生長因子多肽能夠直接促進(jìn)成骨分化，通過納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與化學(xué)成分協(xié)同促進(jìn)成骨分化，進(jìn)一步提高鈦材的早期骨整合性，達(dá)到了本發(fā)明的目的。此外，該方法簡(jiǎn)單直接、周期短、成本較低，因此具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1是掃描電子顯微鏡圖像：未處理鈦材（a），二氧化鈦納米管（b），二氧化鈦納米管-聚多巴胺（c），二氧化鈦納米管-聚多巴胺-成骨生長肽（d）。圖2是原子力顯微鏡圖像：未處理鈦材（a），二氧化鈦納米管（b），二氧化鈦納米管-聚多巴胺（c），二氧化鈦納米管-聚多巴胺-成骨生長肽（d）。圖3是成骨細(xì)胞在經(jīng)過不同處理的鈦材表面的堿性磷酸酶含量，其中*表示兩組間p<0.05，**表示兩組間p<0.01。圖4是成骨細(xì)胞在經(jīng)過不同處理的鈦材表面的礦化含量，其中*表示兩組間p<0.05，**表示兩組間p<0.01。具體實(shí)施方式實(shí)施例1.具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽極，鉑片為陰極，丙三醇與雙蒸水體積比為1比1配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在10V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為30nm的二氧化鈦納米管；c、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，并調(diào)pH至8.5，將步驟b制得的二氧化鈦納米管浸入鹽酸多巴胺溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，進(jìn)一步利用雙蒸水清洗，常溫干燥，制得表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管；d、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為10ng/mL的成骨生長肽溶液，將步驟c所制得的表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管浸入上述成骨生長肽溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，然后利用PBS清洗，常溫干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化鈦納米管。實(shí)施例2.具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽極，鉑片為陰極，丙三醇與雙蒸水體積比為1比1配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在20V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為70nm的二氧化鈦納米管；c、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液溶，并調(diào)pH至8.5，將步驟b制得的二氧化鈦納米管浸入鹽酸多巴胺溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，進(jìn)一步利用雙蒸水清洗，常溫干燥，制得表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管；d、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為10ng/mL的成骨生長肽溶液，將步驟c所制得的表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管浸入上述成骨生長肽溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，然后利用PBS清洗，常溫干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化鈦納米管。分別取經(jīng)過步驟b、c和d制得的二氧化鈦納米管，對(duì)其表面化學(xué)元素進(jìn)行XPS分析,結(jié)果如表1所示，N元素的逐步提高，說明已成功將成骨生長肽固定在二氧化鈦納米管表面。表1、各組樣品表面化學(xué)元素組成（按質(zhì)量百分含量計(jì)算）底物C%O%N%Ti%二氧化鈦納米管21.2154.63024.15表面沉積有聚多巴胺的二氧化鈦納米管58.7726.843.5510.84成骨生長肽修飾的二氧化鈦納米管58.8827.354.369.40由圖1結(jié)果可見，經(jīng)過陽極氧化在鈦材表面形成了管徑為70nm的二氧化鈦納米管，通過沉積多巴胺后，納米管部分被遮蓋，表明表面形成了一層聚多巴胺物質(zhì)，最后通過沉積成骨生長肽后，納米管仍有部分被遮蓋。由圖2結(jié)果可見，經(jīng)過陽極氧化處理后，表面可觀察到山谷樣結(jié)構(gòu)，這與二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)相關(guān)。進(jìn)一步處理后，表面更加粗糙。結(jié)合XPS結(jié)果，表明二氧化鈦納米管表面成功接入成骨生長肽。實(shí)施例3.具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽極，鉑片為陰極，丙三醇與雙蒸水體積比為1比1配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在30V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為100nm的二氧化鈦納米管；c、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，并調(diào)pH至8.5，將步驟b制得的二氧化鈦納米管浸入鹽酸多巴胺溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，進(jìn)一步利用雙蒸水清洗，常溫干燥，制得表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管；d、利用10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制濃度為10ng/mL的成骨生長肽溶液，將步驟c所制得的表面沉積聚多巴胺的二氧化鈦納米管浸入上述成骨生長肽溶液中，室溫避光反應(yīng)過夜，然后利用PBS清洗，常溫干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化鈦納米管。實(shí)驗(yàn)例1．具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管對(duì)成骨細(xì)胞早期分化的促進(jìn)能力取實(shí)施例2經(jīng)過不同處理后得到的“二氧化鈦納米管”、“二氧化鈦納米管-聚多巴胺”和“二氧化鈦納米管-聚多巴胺-成骨生長肽”材料以及未處理純鈦（簡(jiǎn)稱為“鈦材”），在不同材料表面接種新生大鼠頭蓋骨的成骨細(xì)胞，接種密度為1×104/cm2，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天進(jìn)行換液。分別培養(yǎng)4天和7天后，用200μL1%的TritonX-100溶液收集細(xì)胞，2500轉(zhuǎn)離心5min，利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的堿性磷酸酶和蛋白質(zhì)含量，最后用酶標(biāo)儀分別于波長520nm和562nm處測(cè)定吸光度。分別培養(yǎng)4天和7天，用體積分?jǐn)?shù)為1%的TritonX-100溶液收集細(xì)胞，2500轉(zhuǎn)離心5min，利用試劑盒檢測(cè)分別與細(xì)胞上清液中的堿性磷酸酶和總蛋白含量發(fā)生反應(yīng)，分別于波長520nm和562nm下，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。結(jié)果如圖3所示，不論在第4天還是7天，與未處理的鈦相比，在二氧化鈦納米管及聚多巴胺修飾的納米管上生長的細(xì)胞表達(dá)更高的堿性磷酸酶(p<0.05或p<0.01)，說明二氧化鈦納米管能促進(jìn)成骨分化，同時(shí)多巴胺具有良好的生物相容性也能夠促進(jìn)成骨分化。與其他組相比，在成骨生長肽修飾的二氧化鈦納米管上生長的細(xì)胞所表達(dá)的堿性磷酸酶含量最高(p<0.05或p<0.01)，說明二氧化鈦納米管的納米結(jié)構(gòu)和成骨生長肽能夠協(xié)同促進(jìn)成骨分化。實(shí)驗(yàn)例2．具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管對(duì)成骨細(xì)胞后期分化的促進(jìn)能力取實(shí)施例2經(jīng)過不同處理后得到的“二氧化鈦納米管”、“二氧化鈦納米管-聚多巴胺”和“二氧化鈦納米管-聚多巴胺-成骨生長肽”材料以及未處理純鈦（簡(jiǎn)稱為“鈦材”），在不同材料表面接種新生大鼠頭蓋骨的成骨細(xì)胞，接種密度為1×104/cm2，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天進(jìn)行換液。分別培養(yǎng)7天和14天后，在4℃條件下，用2%戊二醛固定20min；用PBS清洗3次，每次5min；加入40mM茜素紅染色20min；蒸餾水清洗3次；加入400μL，10%（v/v）醋酸溶液，搖晃混勻，孵育30min；收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到離心管中，震蕩30s以混合均勻；在85℃條件下，加熱10min；離心15min，將200μL上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；加入氫氧化銨（200μL10%）中和酸；在405nm波長下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)上清液的吸光值。結(jié)果如圖4所示，為成骨細(xì)胞在不同材料上的礦化情況。與未處理的鈦材相比，細(xì)胞在二氧化鈦納米管和聚多巴胺修飾的二氧化鈦納米管上表現(xiàn)較高的礦化含量（p<0.05）。以其它組相比，在成骨生長肽修飾的二氧化鈦納米管上生長的細(xì)胞所表達(dá)的礦化含量最高（p<0.01）。結(jié)果表明成骨生長肽修飾的二氧化鈦納米管促進(jìn)了成骨細(xì)胞后期分化。經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)步驟，可以獲得具良好促成骨作用的二氧化鈦納米管。上述實(shí)施方案中需要注意的問題是：所有與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的儀器設(shè)備和試劑都必須無菌，所有涉及細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟都必須嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。盡管通過上述實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了較為詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可以根據(jù)
發(fā)明內(nèi)容和實(shí)施例部分所描述的技術(shù)內(nèi)容，在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3